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Dec 24, 2023

Una tubería para la evaluación agnóstica de malignidad y terapia de la respuesta a fármacos contra el cáncer utilizando mediciones de masa celular

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1295 (2022) Citar este artículo

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El 6 de enero de 2023 se publicó una corrección del editor de este artículo.

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La medicina funcional de precisión ofrece un complemento prometedor para la orientación de la terapia del cáncer basada en la genómica al probar la eficacia de los medicamentos directamente en las células tumorales de un paciente. Aquí, describimos un flujo de trabajo que utiliza mediciones de masa de una sola célula con imágenes de campo claro en línea y clasificación de imágenes basada en aprendizaje automático para ampliar la utilidad clínica de tales pruebas funcionales para el cáncer. Usando estas mediciones de masa seleccionadas por imágenes, caracterizamos las señales de respuesta de masa para 60 fármacos diferentes con varios mecanismos de acción en doce tipos de células diferentes, lo que demuestra una capacidad mejorada para detectar la respuesta de varios fármacos de acción lenta en comparación con los ensayos de viabilidad celular estándar. Además, usamos este flujo de trabajo para evaluar las respuestas a los medicamentos para varios formatos de muestras de tumores primarios, incluidos sangre, médula ósea, aspirados con aguja fina (FNA) y fluidos malignos, todos con informes generados en dos días y con resultados consistentes con las respuestas clínicas de los pacientes. La combinación de medición de alta resolución, amplia aplicabilidad de fármacos y neoplasias malignas, y el rápido retorno de los resultados que ofrece este flujo de trabajo sugiere que es muy adecuado para realizar una evaluación funcional clínicamente relevante de la respuesta a los fármacos contra el cáncer.

Los biomarcadores efectivos para la oncología de precisión requieren enfoques de medición que, además de predecir la respuesta del paciente a la terapia, permitan la recopilación de datos dentro de las limitaciones de la atención clínica rutinaria del cáncer. Las limitaciones clave incluyen cantidades limitadas de muestras de tumores para caracterización, heterogeneidad biológica y el requisito de devolución rápida de resultados para garantizar la capacidad de acción clínica.

Los biomarcadores genómicos se han convertido en el estándar de oro para guiar la elección de la terapia en oncología de precisión, demostrando un beneficio clínico notable para varias alteraciones genómicas bien definidas1,2,3. Sin embargo, resultados clínicos recientes han demostrado que tales enfoques basados ​​en la genómica siguen teniendo un alcance limitado. En particular, el estudio del Instituto Nacional del Cáncer: Análisis Molecular para la Elección de la Terapia (NCI-MATCH) encontró que menos del 20 % de los pacientes fueron asignados a una terapia basada en la identificación de una mutación accionable4. Al considerar también los resultados de los pacientes, estudios recientes han encontrado que aproximadamente el 5-7 % de los pacientes demuestran un beneficio clínico de las terapias dirigidas al genoma5,6. Además, los pacientes que inicialmente responden al tratamiento a menudo desarrollan resistencia, momento en el que el análisis posterior de las mutaciones procesables rara vez ofrece información adicional para guiar el tratamiento posterior7. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de nuevas herramientas que complementen los enfoques genómicos para permitir la selección racional de terapias para una población más amplia de pacientes con cáncer.

La medicina funcional de precisión ofrece uno de esos enfoques8,9. Mientras que los biomarcadores moleculares, histológicos y genómicos para predecir la respuesta a los medicamentos contra el cáncer se basan en mediciones indirectas de la función celular para informar potencialmente la selección de medicamentos, la medicina funcional de precisión mide el efecto de medicamentos específicos directamente en células vivas aisladas del tumor de un paciente. Este enfoque tiene la ventaja de ofrecer un biomarcador verdaderamente personalizado para la eficacia potencial del fármaco. Sin embargo, la necesidad de células vivas presenta distintos desafíos para las pruebas, incluida la celularidad limitada que ofrecen los formatos de muestras más accesibles desde el punto de vista clínico, la pérdida de viabilidad celular y la rápida deriva fenotípica ex vivo. Debido a estas limitaciones, muchos esfuerzos recientes de desarrollo en medicina funcional de precisión se han centrado en neoplasias malignas hematológicas donde el acceso a una gran cantidad de células vivas de una muestra tumoral fresca es más factible de manera rutinaria10,11,12,13,14,15. Sin embargo, la aplicación más amplia de estos enfoques a los tumores sólidos sigue siendo un desafío y, a menudo, requiere un cultivo prolongado para expandir las células ex vivo para permitir la prueba de respuesta a fármacos16,17,18. A pesar de los recientes avances alentadores para probar fármacos más rápidamente en células tumorales sólidas recién aisladas19, estos biomarcadores aún tienen que traducirse en flujos de trabajo que permitan realizar pruebas clínicas de rutina.

Los requisitos clave para una prueba funcional ampliamente aplicable para la respuesta a los medicamentos contra el cáncer incluyen (1) Flexibilidad: la prueba debe ser compatible con varios formatos de muestras de tumores que se recolectan como parte de la atención clínica estándar y el biomarcador debe demostrar la capacidad de detectar la respuesta a los medicamentos de diferentes clases (2) Sensibilidad y solidez: el ensayo debe ser capaz de identificar cambios sutiles en las poblaciones celulares de muestras muy heterogéneas. (3) Velocidad: la pérdida de viabilidad celular y la rápida deriva fenotípica ex vivo a menudo impiden las estrategias de dosificación de fármacos a largo plazo antes de la evaluación de la respuesta. Además, para guiar de manera efectiva la toma de decisiones terapéuticas, particularmente para pacientes con enfermedades avanzadas o progresivas, los resultados del ensayo deben devolverse en un marco de tiempo clínicamente procesable.

Las mediciones de masa de una sola célula son especialmente adecuadas para cumplir con los requisitos de traducción para los ensayos de medicina de precisión funcional. Como lectura biofísica integradora del fenotipo, se ha demostrado que la masa celular cambia rápidamente en respuesta al tratamiento con fármacos eficaces y, como medida unicelular, las poblaciones se pueden caracterizar utilizando un número relativamente pequeño de células20,21,22,23 ,24. Además, se ha demostrado que estas mediciones del cambio en la masa celular se correlacionan con la respuesta al tratamiento del paciente en una variedad de neoplasias malignas23,24. Sin embargo, al igual que con otros enfoques de medición funcional, los desafíos logísticos y técnicos de realizar estas mediciones de células vivas continúan limitando su aplicabilidad clínica.

Aquí describimos un flujo de trabajo integral que amplía el espacio de aplicación potencial de las pruebas de respuesta a fármacos basadas en la masa de una sola célula al demostrar la viabilidad de usar este enfoque para evaluar la eficacia de los fármacos en varios formatos de muestras primarias de tumores malignos tanto hematológicos como sólidos. (Figura 1). Utilizando protocolos de aislamiento de células tumorales y envío específicos para varios formatos de muestras, se generan suspensiones unicelulares viables (Métodos). Después del tratamiento farmacológico durante la noche in vitro, las distribuciones de masa de estas poblaciones de células se miden utilizando una plataforma de microfluidos que incorpora un resonador de microcanal suspendido (SMR). El sensor SMR permite mediciones de alta precisión de la masa celular en una configuración de canal de flujo simple, como se describe ampliamente en otro lugar25,26,27. Además de las mediciones de masa, se recopilan imágenes de campo claro para cada partícula que pasa por el sensor de masa y, posteriormente, se anotan mediante un clasificador de imágenes basado en una red neuronal convolucional (CNN) para garantizar que solo se utilicen celdas individuales de interés para el análisis estadístico posterior. Este flujo de trabajo completo demuestra una reproducibilidad técnica robusta (Fig. 1 complementaria) y se completa de forma rutinaria en 2 días.

Descripción general esquemática de la línea completa de pruebas de drogas, incluida la recolección y el envío de muestras, aislamiento de células tumorales e incubación de drogas durante la noche, recolección de datos masivos de una sola célula utilizando más de doce instrumentos basados ​​en SMR con imágenes de campo claro vinculadas, clasificación de imágenes aguas abajo, estadística análisis, llamadas de respuesta electrónica e informes de resultados.

Usando esta tubería, se puede probar una amplia gama de terapias dentro de las 24 h de tratamiento, como se demuestra aquí, con respuestas masivas dependientes de la dosis para 60 medicamentos diferentes con diferentes mecanismos de acción en varias líneas celulares. Además, demostramos la viabilidad de realizar estas mediciones para varios formatos diferentes de muestras de tumores mínimamente invasivos que se recolectan comúnmente como parte de la atención clínica de rutina. Estos incluyen sangre, médula ósea, muestras de bajo ingreso como aspirados con aguja fina (FNA) y fluidos malignos como derrames pleurales. Juntos, estos resultados demuestran que una prueba basada en mediciones de masa de una sola célula anotadas en imágenes tiene el potencial de ofrecer una amplia utilidad, es resistente a la complejidad biológica de muestras clínicas relevantes para la traducción y puede ejecutarse en un marco de tiempo clínicamente procesable.

Para capturar la respuesta de la masa celular al tratamiento con una significación estadística adecuada, utilizamos el formato de flujo continuo de SMR, lo que permite mediciones de masa de células individuales23,24,25,26,27. Un sensor SMR se compone de un voladizo suspendido con un canal microfluídico integrado en forma de U28 (Fig. 1c). A medida que una celda pasa a través del canal integrado, la masa del voladizo se altera transitoriamente, lo que induce un breve cambio en la frecuencia resonante proporcional a la masa flotante de la celda, denominada "masa" en este documento (Métodos). El esquema de control fluídico implementado en el instrumento (Fig. 2 complementaria), junto con el chip SMR, nos permite medir consistentemente muestras de 5000 células de un volumen de 50 μl en 10 min.

Para medir la respuesta al tratamiento de una muestra de paciente, primero aislamos las células cancerosas de la muestra (Fig. 2a) e incubamos las células en alícuotas con medicamentos o combinaciones de medicamentos (Métodos). Luego hacemos fluir las poblaciones celulares a través del sensor de masa para capturar sus funciones de distribución de probabilidad de masa celular, a las que nos referiremos como distribuciones de masa en este documento. Como ejemplo, la Fig. 2a muestra tres distribuciones de masa distintas: una distribución de referencia de células tratadas con vehículo (gris) y dos distribuciones de células tratadas con fármaco (azul y púrpura). Comparamos las distribuciones de las células tratadas con las de las células de referencia utilizando la Distancia del motor de la tierra (EMD), una medida de similitud estadística, y cuantificamos la diferencia como una señal de "respuesta masiva" (Fig. 2b, Métodos). Medimos una respuesta de masa más grande para distribuciones de masa divergentes (valor de EMD más alto, azul versus gris) y una respuesta de masa más pequeña cuando las distribuciones de masa son similares (valor de EMD más bajo, púrpura versus gris). Para lograr una métrica agnóstica de malignidad que se pueda usar en varios tipos de muestras de tumores, normalizamos cada medición de masa de una sola célula por la masa media de las células tratadas con vehículo en la muestra, lo que da como resultado una señal de respuesta de masa sin unidades que informa el cambio de masa (en porcentaje) en relación con el control (Fig. 2b).

a Primero, las células cancerosas aisladas se dosifican y se incuban con los fármacos que se probarán (azul y morado) o con el control tratado con vehículo (gris). El instrumento SMR mide la masa de las células individuales de cada población para determinar la distribución de la masa de las células tratadas (curvas azules y moradas) y las células de referencia no tratadas (curva gris). b Se comparan las distribuciones de masa de las células tratadas y de referencia para determinar la respuesta de masa al tratamiento. La señal de respuesta de masa es la distancia estadística entre las dos distribuciones de masa calculada por la distancia del motor de tierra (métodos). La comparación de dos distribuciones similares (morado frente a gris) produce una señal de respuesta de masa más pequeña, mientras que la comparación de distribuciones divergentes (azul frente a gris) da como resultado una señal de respuesta de masa más grande. c Representación esquemática que muestra la estructura de la prueba de respuesta de masa. Las células de control tratadas con vehículo se miden tanto antes como después de las células que se tratan con los fármacos que se están probando. Este enfoque permite medir una señal de respuesta de masa de referencia entre dos poblaciones de control (referencia frente a control), que captura posibles cambios de masa variables en el tiempo debido a efectos in vitro. d Gráfica de respuesta de masa que muestra las señales de respuesta de masa de las células de control y tratadas que se muestran en (a) y (b). Los intervalos de confianza del 95 %, que se muestran como líneas superpuestas en cada punto, se calculan mediante arranque utilizando datos de masa de una sola celda (Métodos). Los valores de p se determinan comparando la diferencia de magnitud de respuesta de masa de PRUEBA y CTRL con un umbral de "límite de decisión" del 3% (Métodos). * indica p < 0,05, ns indica p > 0,05.

Al igual que con otras pruebas estadísticas basadas en la población, la precisión de la medición de la respuesta de masa se basa en qué tan bien las poblaciones de células muestreadas representan la distribución real en la muestra del tumor. Para comprender el impacto de los parámetros de medición de masa, como el ruido del sensor y la cantidad de celdas medidas, realizamos simulaciones utilizando los datos que se muestran en la Fig. 2a (Fig. 3a, b complementarias). La medición de al menos 2500 celdas para calcular una distribución de masa limita el ruido de referencia en la señal de respuesta de masa entre muestras idénticas a menos del 1,5 % y la desviación estándar de la respuesta de masa a menos del 1 %, mientras que cuando la medición se basa en una muestra de 500 células, estos parámetros son 3 y 1%, respectivamente.

Debido a la heterogeneidad biológica inherente de las muestras de pacientes, las células individuales aisladas dentro de una muestra pueden mostrar diferentes niveles de respuesta al tratamiento. Por lo tanto, la linealidad de la señal es un atributo fundamental para traducir con precisión el cambio de masa inducido por el tratamiento en una respuesta de masa lineal que se puede comparar entre muestras, fármacos y dosis de tratamiento. Como demostración, simulamos magnitudes variables de respuestas de masa mediante el muestreo de células en diferentes proporciones de las distribuciones tratadas y de referencia que se muestran en la Fig. 2a. Mostramos que la señal de respuesta de masa es una función lineal de la proporción de células que responden en la muestra (Fig. 3c complementaria).

Un objetivo clave de las pruebas funcionales es permitir que las mediciones se realicen en escalas de tiempo cortas, idealmente en menos de 48 horas, minimizando el impacto de la posible desviación fenotípica y el cambio de viabilidad de las células cancerosas primarias que se están probando. Para garantizar resultados de respuesta al tratamiento precisos y confiables, medimos las células tratadas con vehículo dos veces, tanto antes como después de las poblaciones de células tratadas, para tener en cuenta cualquier desviación fenotípica en el transcurso de la medición de masa, que puede demorar algunas horas cuando se prueban varias condiciones. Para la mayoría de los medicamentos presentados aquí, se usa dimetilsulfóxido (DMSO) para la disolución y, por lo tanto, el tratamiento con DMSO (0,25 %) solo sirve como control del vehículo. Las medidas de masa de las células tratadas con DMSO al 0,25 % son indistinguibles de las células no tratadas, lo que sugiere un efecto mínimo del DMSO solo en la masa celular (Fig. 1 complementaria). La Figura 2c demuestra la estructura del enfoque de medición. En primer lugar, se mide una población de células tratadas con vehículo para utilizarlas como distribución de "referencia". Luego, se miden las células que fueron expuestas al tratamiento. Las "condiciones" de múltiples tratamientos se pueden medir secuencialmente después de las celdas de referencia para probar un panel de fármacos. Finalmente, una segunda condición de réplica de células tratadas con vehículo se mide como "control". Para cuantificar los cambios independientes del tratamiento en las células tratadas con vehículo a lo largo de la duración de la medición, calculamos la respuesta de masa entre el control tratado con vehículo y las distribuciones de referencia (CTRL en la Fig. 2d). Para cuantificar la respuesta celular al tratamiento, calculamos la respuesta de masa entre las células tratadas con fármaco y las células de referencia tratadas con vehículo (PRUEBA en la Fig. 2d). La comparación de las señales de PRUEBA y CTRL mediante el arranque29 para confirmar una diferencia de magnitud de señal mayor que un umbral de "límite de decisión" produce un valor p para interpretar el resultado de la respuesta al tratamiento (Métodos). Por ejemplo, una distancia medida entre los puntos azules y grises en la Fig. 2d mayor que el límite de decisión con un valor p correspondientemente bajo indicaría que las células tratadas con el fármaco probado cambiaron su masa en relación con las células de control en un nivel significativo. Un valor p alto que rechace la hipótesis indicaría, en cambio, que no hay respuesta al tratamiento (punto morado en la Fig. 2d). En este documento, definimos el límite de decisión de tres sigma30 como 3 % en todas las mediciones, lo que corresponde a tres veces la desviación estándar de la distancia entre 500 células muestreadas repetidamente de una población de células (Figura complementaria 3a).

Para probar la solidez de nuestro enfoque, simulamos la deriva fenotípica celular en forma de pérdida de masa en función del tiempo (Fig. 3d complementaria). Probamos diferentes tasas de pérdida de masa por tiempo para las células para identificar los límites de la medición para capturar correctamente la respuesta de las células tratadas. Suponiendo una tasa lineal de desviación fenotípica en función del tiempo, encontramos que para resolver correctamente una magnitud de respuesta de masa del 5 % (en relación con el control), la desviación fenotípica de las células tratadas con vehículo debe ser inferior al 10 %. No hemos observado tasas de deriva fenotípica que excedan este número para ninguna línea celular o especímenes primarios informados aquí. No obstante, nuestro enfoque nos permite identificar una deriva fenotípica significativa al monitorear la distancia entre las celdas de referencia y de control, como se muestra como la señal CTRL (Fig. 2d). Si se encuentra que esta distancia es superior al 10%, concluimos que la prueba no es concluyente debido a una alta desviación fenotípica.

A pesar de la alta eficacia de los kits de enriquecimiento de células disponibles comercialmente (Métodos), las muestras de tumores primarios procesadas a menudo contienen desechos biológicos y agregados celulares además de células individuales de interés. Debido a que las mediciones de masa por sí solas no pueden distinguir entre estos diferentes tipos de partículas, este material adicional puede interferir con la capacidad de detectar cambios inducidos por fármacos en las distribuciones de masa. Para abordar este desafío, implementamos imágenes de campo claro en línea con el sensor de masas (Fig. 1) con detección de partículas ópticas en tiempo real inmediatamente después para activar la captura de imágenes. Cada medición de masa se empareja con su imagen de campo claro correspondiente y se anota utilizando la clasificación de imágenes basada en CNN. Esta clasificación de imágenes se produce en dos etapas. En primer lugar, se utiliza un clasificador CNN binario para identificar qué eventos unicelulares aceptar y qué eventos no unicelulares rechazar, como desechos y agregados celulares. Cada evento aceptado se clasifica aún más como una sola célula intacta o permeable y cada evento rechazado se caracteriza como un agregado o desechos utilizando dos clasificadores CNN binarios adicionales (Fig. 3a).

a Representación esquemática del enfoque de clasificación de imágenes de varios pasos implementado en el flujo de trabajo representado en la Fig. 1. Una imagen de entrada se clasifica primero como aceptada o rechazada con un clasificador CNN binario y, posteriormente, todas las partículas aceptadas se clasifican como intactas o La célula permeable y todas las partículas rechazadas se clasifican como agregados o desechos con dos clasificadores CNN binarios adicionales. Las imágenes insertadas son representativas de cada clase. Los porcentajes entre paréntesis enumerados en cada nodo de decisión binaria indican el rendimiento del modelo con validación cruzada, enumerando los valores de precisión y recuperación, respectivamente (Métodos). b Gráficas de violín que muestran las distribuciones de masa para una población completa de células sin clasificación de imágenes (blanco), así como partículas dentro de la población que se clasificaron como agregados (púrpura), células intactas (gris), células permeables (rosa) o desechos (azul ) para un modelo de línea celular de cáncer de pulmón humano (PC9) y una línea celular de mieloma múltiple humano (MM1S). c La clasificación de imágenes de celda única reduce el ruido en la señal de respuesta de masa al reducir el error de muestreo. Como demostración, muestreamos aleatoriamente 1000 células 100 veces de una condición medida con y sin curación de imágenes y calculamos la respuesta de masa media dentro de estos dos conjuntos que representan el error de muestreo con y sin curación de imágenes. Cuando esto se repite para todas las mediciones presentadas en este documento, incluidas 3222 condiciones medidas en 13 instrumentos diferentes, encontramos que la curación de imágenes reduce el error de muestreo en un 16,2 % en promedio. Se muestra un ejemplo de un par de distribuciones de masa con (gris) y sin (blanco) curación de imágenes, lo que indica la presencia de agregados celulares y poblaciones de desechos en el conjunto de medidas original, que posteriormente se eliminan mediante el proceso de curación de imágenes.

Entrenamos los modelos de CNN utilizando imágenes seleccionadas manualmente de cada clase recolectada para una variedad de líneas celulares y muestras de tumores primarios para garantizar la generalización en varios formatos de muestras (Métodos). Cuando se aplican a conjuntos de imágenes seleccionadas manualmente, estos modelos logran valores de recuperación y precisión con validación cruzada que superan el 97 % para cada clase de imagen (Fig. 3a).

En este conjunto de entrenamiento, las imágenes con partículas pequeñas o material fibroso se clasifican como desechos, y las imágenes con grupos de células claramente segmentados se clasifican como agregados. La discriminación de células intactas y permeables se basa principalmente en el contraste reducido observado en células que presumiblemente han perdido la integridad de su membrana. Esta pérdida de contraste observada por imágenes de campo claro es consistente con los datos de viabilidad recopilados en paralelo con la evaluación de citometría de flujo de DAPI, un tinte de intercalación de ADN que es más accesible a los núcleos de células no viables que han perdido una membrana celular funcional (Fig. . 4).

La utilidad de las mediciones de masa de una sola célula anotadas en imágenes se puede ver al comparar las distribuciones de masa de cada clase de partículas para líneas celulares con diferentes características de masa de referencia (Fig. 3b). Las células de cáncer de pulmón humano (PC9) y las células de mieloma múltiple humano (MM1S) tienen distribuciones de masa subyacente significativamente diferentes. Dada esta variación, depender únicamente de las mediciones de masa para identificar células individuales frente a desechos o eventos agregados basados ​​en activación universal no sería factible en varios tipos de células. Por el contrario, la anotación y clasificación de imágenes ofrecen un medio ampliamente aplicable para identificar partículas de interés en varias muestras, como se puede ver con las tendencias de masa constantes en las clases de partículas observadas en estas dos líneas celulares, con agregados de células que tienen la masa más grande seguidos de células intactas. células, células permeables y desechos. Esta flexibilidad permite la identificación de células individuales para análisis posteriores, independientemente de la estructura subyacente de la distribución de masa de una muestra dada. Esta capacidad mejorada para caracterizar las distribuciones de masa de una sola célula es un requisito clave para identificar de manera sólida las respuestas al tratamiento. Para cuantificar el beneficio de las imágenes vinculadas, comparamos el error de muestreo entre subconjuntos aleatorios de celdas extraídas de todas las mediciones de masa recopiladas en una condición o solo de las mediciones de masa anotadas como aceptadas por la clasificación de imágenes (Fig. 3c). En 3222 conjuntos de datos diferentes recopilados para un rango de celdas primarias y líneas celulares, encontramos que la selección de imágenes mejoró significativamente esta variabilidad de muestreo, con una disminución promedio en el error de muestreo del 16,2 % en comparación con las mediciones no seleccionadas de la misma condición. Curiosamente, los eventos "Agregados" parecían dar cuenta de un mayor error de muestreo que los eventos "Desechos" al considerar cada clase individualmente (Figura complementaria 4b, c). Estos resultados demuestran la capacidad de las imágenes vinculadas para mejorar la confiabilidad del muestreo de una distribución de masa subyacente, particularmente en el contexto de muestras altamente heterogéneas donde solo un subconjunto limitado de las mediciones son células individuales.

Al considerar los cambios en la masa celular que pueden ocurrir en respuesta al tratamiento, definimos tres categorías potenciales relacionadas con el mecanismo de acción (MOA) de un fármaco: (1) cambios debido a la detención del ciclo celular, (2) cambios debido a la interrupción de los procesos metabólicos , y (3) cambios debido a fallas en la integridad estructural de la celda (Fig. 4a). Usando un conjunto básico de suposiciones sobre la naturaleza de cada tipo de mecanismo de respuesta a fármacos, podemos crear modelos simples que demuestren los cambios esperados en la masa en una población de células individuales. En el caso de la detención del ciclo celular, esperamos que la distribución de masa se consolide gradualmente alrededor de la masa celular promedio de recién nacidos para la detención G0/G1 o alrededor de la masa celular promedio antes de la división para la detención G2/M (Fig. 4b). El trabajo anterior ha demostrado que la interrupción de las vías metabólicas puede manifestarse como cambios en la masa de una sola célula31. Estos efectos pueden desviarse hacia procesos anabólicos o catabólicos, lo que da como resultado células más grandes o más pequeñas, respectivamente, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 4b. Se espera que la alteración de la integridad estructural de las células provoque los mayores cambios en la masa de una población, ya que esta categoría es compatible con la apoptosis y/o la necrosis de las células, y es probable que la pérdida de masa se deba a cambios físicos drásticos en las células, como la pérdida de integridad de la membrana/citoplasma, formación de ampollas en la membrana, fragmentación celular y otros procesos. Aquí, asumimos que grandes cantidades de pérdida de masa harán que las células cambien de su distribución inicial tratada con vehículo hacia una distribución secundaria mínimamente superpuesta (Fig. 4b).

Las terapias con diferentes mecanismos de acción (MOA) inducen diferentes firmas de respuesta masiva características. Como se muestra en (a), estas firmas de MOA capturan los efectos de las drogas que pueden clasificarse libremente en tres categorías generales, que incluyen la detención del ciclo celular, la interrupción metabólica o la pérdida de integridad estructural. b Demostraciones esquemáticas de los cambios en las distribuciones de masa entre una población de control (relleno gris, línea punteada) y una población tratada con fármacos (relleno rojo, línea continua) causados ​​por detención de G1, detención de G2, sesgo catabólico, sesgo anabólico o membrana celular pérdida. c Ejemplo de cambios de distribución de masa experimentales en respuesta al tratamiento farmacológico correspondiente a cada resultado esquemático presentado directamente arriba en (b). d Mediciones de respuesta de masa recopiladas con tres instrumentos diferentes (puntos individuales con barras de error correspondientes al intervalo de confianza del 95 % de EMD para cada sistema definido por 5000 muestras aleatorias de 2500 celdas), correspondientes a los datos experimentales presentados directamente arriba en (c).

Los medicamentos con los MOA descritos aquí son razonablemente comunes, al igual que las líneas celulares homogéneas que responden a estos medicamentos, lo que nos permite probar estos modelos hipotéticos. Para probar el resultado de la respuesta masiva de la detención de G0/G1, expusimos la línea celular H1666 de cáncer de pulmón humano a trametinib 10 uM, un inhibidor de MEK, durante 17 h, que detiene la mayoría de las células en G1 temprano (Fig. 5a complementaria)32. De acuerdo con las expectativas, vimos que la distribución de la masa celular se desplazaba hacia abajo en comparación con el control (Fig. 4c, d). Por el contrario, al tratar las células MDA-MB-361 durante 24 h con docetaxel 10 nM, un inhibidor de microtúbulos que previene la división celular, observamos un cambio significativo hacia arriba en la masa (Fig. 4c, d y Fig. 5b complementaria). Estos dos fenotipos de detención del ciclo celular son fundamentales para la actividad de muchos medicamentos, tanto inhibidores dirigidos como quimioterapias, y la respuesta masiva resuelve estos fenotipos de manera sólida en muchos ejemplos (Fig. 6 complementaria). Para producir datos de sesgo metabólico, tratamos las células con cicloheximida, un inhibidor ribosómico, o carfilzomib, un inhibidor del proteasoma, para sesgar el metabolismo hacia el catabolismo o el anabolismo, respectivamente. En células L1210 tratadas con cicloheximida 400 nM durante 24 h, observamos una disminución en la masa celular promedio en la población, lo que es consistente con la inhibición de la biogénesis de proteínas33. Si observamos las células U266 tratadas con 50 nM del inhibidor del proteosoma Carfilzomib durante 6 h, observamos en cambio un aumento sutil en la masa promedio de células, consistente con la acumulación excesiva de proteínas antes de la citotoxicidad aguas abajo (Fig. 4c, d)34. Por último, como ejemplo de alteración estructural completa, utilizamos células L1210 tratadas con detergente Tween 20 al 0,5 % durante 10 min, que permeabiliza la membrana celular y se añade al 40 % a una población celular sana. Aquí, observamos una disminución en el pico de masa primaria que representa las células vivas y un aumento en el pico más pequeño, que representa las células permeabilizadas (Fig. 4c, d). Estos mismos cambios en las distribuciones de masa se pueden observar para las células después de la muerte celular inducida por fármacos clínicamente relevantes (Fig. 7 complementaria).

La capacidad de las distribuciones de masa para discernir estos diferentes perfiles de respuesta lo hace ideal para detectar la respuesta a fármacos en muestras primarias heterogéneas. La naturaleza dinámica de estos mecanismos de cambio de masa, combinada con la heterogeneidad en el momento de la respuesta celular y la deriva fenotípica potencial ex vivo, significa que la presentación de estos mecanismos no es necesariamente uniforme en una población de células. Por ejemplo, incluso en líneas celulares homogéneas, como las células PC9 tratadas con doxorrubicina, diferentes dosis del fármaco en un solo punto de tiempo muestran cómo la señal de respuesta masiva puede manifestarse tanto por la detención del ciclo celular como por la interrupción estructural, ya sea sola o simultáneamente (Fig. . 8).

Además de la compatibilidad con varios mecanismos farmacológicos, cuando se considera el papel de la medición de la respuesta de masa en un proceso clínico, también es importante demostrar la compatibilidad con muestras de células tumorales heterogéneas que tienen una ventana de tiempo limitada de estabilidad fenotípica ex vivo durante la cual la sensibilidad farmacológica puede ser evaluado. Por lo tanto, es importante evaluar los efectos de la concentración y el tiempo del fármaco, así como la heterogeneidad de respuesta subyacente en las lecturas de respuesta masiva.

El enfoque canónico utilizado para caracterizar la sensibilidad a los fármacos en función de la dosis y el tiempo es la curva de dosis-respuesta basada en la viabilidad o la curva IC50. Como tal, una variedad de marcadores y técnicas de viabilidad (es decir, MTT, ATP, citometría de flujo) han mostrado potencial como biomarcadores funcionales para el cuidado del cáncer, pero el impacto de estos enfoques en el contexto de las muestras de tumores primarios a menudo se ha visto limitado por el número de células requeridas y el tiempo necesario para realizar estos ensayos1. Sin embargo, como estándar establecido, las curvas IC50 proporcionan un comparador y un modelo útiles para comprender las variables que afectan la respuesta celular a los fármacos. Las mediciones de IC50 barren el espacio de la dosis para definir el punto de inflexión de la dosis por encima del cual la mayoría de las células mueren en respuesta a un fármaco. El momento óptimo para evaluar la respuesta a la dosis basada en la viabilidad suele estar dictado por el mecanismo del fármaco y la línea celular que se está estudiando. Para los fármacos de acción rápida, un punto de tiempo de 24 horas suele ser suficiente para definir con precisión la sensibilidad celular; sin embargo, para fármacos de acción lenta (p. ej., fármacos que funcionan a través de la detención del ciclo celular), puede ser necesario un punto de tiempo de 72 horas o más.

Para evaluar cómo estos parámetros de concentración de dosis y tiempo afectan la respuesta de la masa celular, modulamos estas variables de forma independiente en las líneas celulares para comprender su efecto. Las células MM1S tratadas con un rango de concentraciones de carfilzomib durante un período de tiempo fijo (15 h), mostraron una respuesta de masa dependiente de la dosis similar a las curvas IC50 recolectadas para la misma línea celular (Fig. 5a). También notamos que la respuesta de masa cambia con el tiempo en respuesta a una concentración fija de fármaco (Fig. 5b). Para los fármacos de acción rápida, que inducen rápidamente la citotoxicidad, la magnitud de la respuesta masiva demuestra una dependencia de la dosis en línea con las mediciones de pérdida de viabilidad recopiladas en puntos de tiempo similares (Fig. 5c y Fig. 9a, b complementarias). Sin embargo, como resultado de poder detectar señales antes de la muerte celular, la respuesta masiva puede detectar los efectos de los medicamentos de acción lenta mucho antes de una pérdida de viabilidad del 50% requerida para definir una señal IC50 precisa (Fig. 5d y Fig. Suplementaria). 9c, d). Por ejemplo, en el caso de las células PC9 tratadas con paclitaxel, las mediciones de masa de 24 h definen con precisión un punto de inflexión dosis-respuesta que revela concentraciones efectivas del fármaco, a pesar de los cambios mínimos en la viabilidad observados en todas las concentraciones probadas y las mediciones de IC50 que requieren 72 h para una lectura más precisa (Fig. 5d). Cuando esta comparación se realiza en 60 medicamentos diferentes probados en 12 líneas celulares diferentes, se aclara el valor de esta señal de respuesta masiva que se manifiesta rápidamente (Fig. 5e y Datos complementarios 1). Para muchos fármacos, ya sean inhibidores de la cinasa dirigidos o quimioterapias, un valor de IC50 de 24 h es comparable a la respuesta de masa medida con una señal basada en la masa que se desarrolla a la misma dosis del fármaco o solo ligeramente inferior a la observada por las mediciones de viabilidad. Sin embargo, para los fármacos que funcionan a través de mecanismos de acción más lenta, como la detención del ciclo celular, las mediciones de respuesta de masa de 24 h todavía definen las concentraciones efectivas del fármaco, mientras que las mediciones de IC50 de 24 h brindan poca perspectiva. En su lugar, se deben tomar puntos de tiempo de IC50 de 72 horas o más para definir la sensibilidad celular a tales fármacos (Fig. 5e). Esta capacidad de detectar rápidamente los cambios inducidos por fármacos en el fenotipo celular es particularmente beneficiosa en el contexto de las mediciones de tejidos primarios donde las incubaciones de fármacos a largo plazo son inviables debido a la deriva fenotípica y la pérdida de viabilidad ex vivo.

La señal de respuesta de masa varía con los cambios en la dosis o el momento de la medición, de forma similar a las mediciones de viabilidad celular. La respuesta de masa de las células MM1S tratadas con carfilzomib se muestra cuando se varía la dosis en un punto de tiempo de 15 horas o cuando se varía el punto de tiempo con una dosis de 150 nM. Los puntos múltiples indican instrumentos independientes, las líneas superpuestas indican un intervalo de confianza del 95 % para la respuesta de masa definida por 5000 muestras aleatorias de 2500 células. c Células MM1S tratadas con el fármaco de acción rápida venetoclax durante 15 h, y d Células PC9 tratadas con el fármaco de acción lenta paclitaxel durante 24 h, comparando la respuesta a la dosis medida en masa (eje rojo, los cuadrados rojos muestran mediciones de respuesta de masa representativas, las líneas superpuestas indican un intervalo de confianza del 95 %) o una evaluación de viabilidad basada en citometría de flujo utilizando DAPI y anexina V (eje azul, círculos azules, líneas superpuestas indican un intervalo de confianza del 95 %) (Métodos). e Mapa de calor que muestra una respuesta masiva de líneas celulares (leyenda superior) a 60 fármacos diferentes, comparando la magnitud de la respuesta (gradiente rojo; determinada por la diferencia entre el control y las condiciones de prueba) para dosis ordenadas a 24 h IC50 (negro líneas) o valores IC50 a largo plazo (círculos abiertos). Los valores de IC50 a largo plazo solo se proporcionan para medicamentos en los que la IC50 de 24 h es infinita o mayor que la concentración más alta utilizable para la prueba. Los fármacos se ordenan en el eje x con respecto a sus valores de IC50 de 24 h. La respuesta de masa observable a dosis por debajo de las mediciones de IC50 a corto y largo plazo para una combinación dada de célula/fármaco indica que los cambios de masa corresponden o preceden a la pérdida de viabilidad para todos los fármacos presentados. *** indica p < 0,001, ns indica p > 0,05.

Si bien las líneas celulares homogéneas brindan un buen contexto para probar las características fundamentales de las mediciones de respuesta masiva, no son buenos indicadores de la heterogeneidad observada en las muestras de tumores primarios. Por esta razón, es importante evaluar el impacto de la heterogeneidad en las medidas de respuesta de masa. Esta variable se puede sondear explícitamente mezclando fracciones tratadas con fármaco y vehículo de la misma línea celular, lo que demuestra que en un momento dado, la respuesta de masa aumenta proporcionalmente a la fracción de células que responden (Fig. 6a). Se necesita un modelo más complejo para emular la distribución heterogénea de tamaños y la sensibilidad a los fármacos en una muestra primaria. Para probar la sensibilidad fraccional teniendo en cuenta esta heterogeneidad, utilizamos una mezcla de tres líneas celulares, cada una con una sensibilidad única a un fármaco individual (Fig. 6b). Cuando observamos la respuesta usando combos de 1 fármaco versus 2 o 3 fármacos, vemos un cambio aditivo en la respuesta masiva que es aproximadamente la suma de las respuestas para cada fármaco como monoterapia (Fig. 6b).

a Mediciones de respuesta masiva tomadas en células MM1S, donde el control del vehículo y las células tratadas con carfilzomib se mezclaron después del tratamiento para crear poblaciones celulares con fracciones definidas de células que responden. b Una combinación 1:1:1 de células MM1S, H929 y KMS-12-PE tratadas durante 15 h con terapias de uno, dos o tres agentes, lo que demuestra la señal aditiva que se observa a medida que aumenta la fracción sensible de células en respuesta al tratamiento combinado. Los puntos múltiples indican instrumentos independientes, las líneas superpuestas indican un intervalo de confianza del 95 % para la respuesta de masa definida por 5000 muestras aleatorias de 2500 células. *** indica p < 0,001, ns indica p > 0,05.

Estos resultados demuestran un alto grado de concordancia entre las mediciones de respuesta de masas y otros ensayos de respuesta de fármacos existentes y muestran que la respuesta de masas puede caracterizar con precisión los efectos del tiempo, la dosis y la heterogeneidad de la muestra. El mayor contenido de información que ofrecen las mediciones de respuesta de masa de una sola célula y su capacidad única para resolver la sensibilidad celular en puntos de tiempo más tempranos aguas arriba de la pérdida de viabilidad ofrecen claras ventajas en la caracterización de células tumorales primarias donde el mantenimiento a largo plazo de las células ex vivo no es práctico.

La composición de la muestra y la viabilidad de la recolección varían significativamente entre los diferentes formatos de muestras clínicas y pueden afectar la facilidad de medición y aislamiento celular. Por lo tanto, una tubería de prueba funcional debe ser compatible con muestras recolectadas de una variedad de compartimentos de células tumorales para mantener una amplia aplicabilidad en todas las neoplasias malignas.

El trabajo anterior ha demostrado la viabilidad de utilizar medidas de respuesta de masa para caracterizar la eficacia de fármacos para formatos de muestra de malignidad hematológica como sangre y médula ósea21. Si bien proporciona una prueba de concepto alentadora de que tales lecturas biofísicas pueden predecir con precisión las respuestas del paciente a la terapia, la complejidad técnica del procesamiento de muestras de tumores sólidos nos llevó a probar si nuestro flujo de trabajo de medición de masa anotado en imágenes podría mantener la capacidad de caracterizar la sensibilidad a los medicamentos mientras también ofrece la velocidad, la solidez y la reproducibilidad técnica requeridas de una tubería de pruebas clínicas (Figura complementaria 2b).

Para demostrar primero la compatibilidad de este flujo de trabajo con muestras de tumores hematológicos, presentamos mediciones de una muestra de sangre periférica de un paciente con leucemia de células plasmáticas (LCP) y un aspirado de médula ósea de un paciente con mieloma múltiple (MM) (Fig. 7a , b). En ambos casos, las respuestas de masa celular fueron observables para una variedad de terapias. Las células tumorales aisladas de la muestra de LCP con una demostración previa de la translocación t(11;14) mostraron una respuesta dependiente de la dosis a venetoclax como monoterapia y en combinación con bortezomib y selinexor. Sin embargo, estas células no mostraron una respuesta masiva significativa a selinexor o bortezomib solos, lo que sugiere que la respuesta fue impulsada principalmente por venetoclax. Este paciente había sido tratado previamente con una terapia basada en venetoclax y tuvo una buena respuesta durante cinco meses, como lo indica la erradicación del clon t(11;14) en biopsias de médula ósea diagnósticas posteriores. Sin embargo, el tratamiento se suspendió a los cinco meses debido a efectos adversos (citopenias). La muestra de aspirado de médula ósea de un paciente con mieloma múltiple en recaída/refractario con afectación extramedular conocida demostró una respuesta dependiente de la dosis a la combinación de selinexor, carfilzomib y dexametasona, así como a la combinación de terapia DCEP (dexametasona, ciclofosfamida, etopósido y cisplatino ). Cuando se dosificó como monoterapia, la mayor parte de la respuesta masiva observada con la terapia de combinación se recapituló con la dosificación del análogo de ciclofosfamida mafosfamida, un compuesto que se hidroliza espontáneamente y produce los mismos dos componentes que la ciclofosfamida metabolizada35. Al igual que con las mediciones predictivas anteriores en el mieloma múltiple, las mediciones de respuesta de masa DCEP fueron consistentes con la disminución de la proteína monoclonal sérica del paciente y la respuesta al tratamiento con quimioterapia de combinación de rescate.

Se recogieron mediciones de respuesta de masa para células de leucemia de células plasmáticas (PCL) aisladas de una muestra de sangre periférica y tratadas durante 15 h con los fármacos enumerados, b células de mieloma múltiple aisladas de una muestra de aspirado de médula ósea y tratadas durante 15 h con los fármacos enumerados , c células aisladas de muestras de aspiración con aguja fina (FNA) recolectadas de una masa pulmonar, masa de cuello y masa ósea de tejido blando en tres pacientes diferentes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, melanoma y cáncer de mama, respectivamente, y tratados por 20 h con los fármacos enumerados, y d células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) aisladas de una muestra de derrame pleural y tratadas durante 20 h con los fármacos enumerados. Para todos los gráficos, cada punto representa la respuesta de masa medida en un instrumento individual, con barras de error correspondientes al intervalo de confianza del 95 % para la respuesta de masa definida por 5000 muestras aleatorias de 2500 celdas. *** indica p < 0,001, ** indica p < 0,01, * indica p < 0,05, ns indica p > 0,05.

Para los pacientes con neoplasias malignas de tumores sólidos metastásicos o en recaída, la evaluación clínica a menudo requiere la recolección de muestras de tejido sólido en lugar de muestras de sangre o médula ósea. La recolección de estos especímenes por medio de resecciones quirúrgicas o, a veces, incluso mediante biopsias centrales, no es factible dado el tamaño y la ubicación anatómica de las lesiones metastásicas, y el deseo de evitar procedimientos invasivos innecesarios. La aspiración con aguja fina (FNA), que utiliza agujas de perfil más bajo en comparación con las biopsias centrales, ofrece una alternativa mínimamente invasiva a la recolección de muestras y reduce el riesgo de sangrado y lesiones36. Para garantizar la máxima utilidad clínica, buscamos determinar la viabilidad de realizar mediciones de respuesta masiva utilizando estas muestras FNA de bajo ingreso, que a menudo producen solo decenas de miles de células individuales para el análisis posterior.

Recolectamos muestras FNA de tres ubicaciones anatómicas diferentes: una masa pulmonar en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), una masa en el cuello en un paciente con melanoma y una masa ósea lítica de tejido blando en un paciente con cáncer de mama ( Figura 7c). Los rendimientos celulares totales fueron de 115, 25 y 120 mil células tumorales para las masas de pulmón, hueso y cuello, respectivamente. Estos especímenes demostraron una gama de respuestas de masa celular a fármacos, con la masa pulmonar mostrando una respuesta de masa significativa a paclitaxel y gemcitabina, la masa del cuello mostrando una respuesta de masa significativa a una combinación de dabrafenib y trametinib, y la masa ósea de tejidos blandos mostrando una respuesta de masa significativa a paclitaxel y gemcitabina. respuesta a docetaxel o doxorrubicina. Curiosamente, el paciente con NSCLC fue tratado posteriormente con una combinación de carboplatino y paclitaxel y demostró una marcada respuesta clínica, consistente con la respuesta masiva al paclitaxel observada para este espécimen. Estas mediciones demuestran la viabilidad de realizar el flujo de trabajo de extremo a extremo con formatos de tejido de entrada baja y son una indicación de que la tubería es compatible con la realización de pruebas de respuesta a fármacos dentro de las limitaciones de las estrategias de manejo clínico actuales para pacientes con tumores malignos sólidos avanzados.

Además de las lesiones metastásicas diseminadas, muchos pacientes con cáncer avanzado acumulan líquidos malignos en forma de derrames pleurales o ascitis abdominal, que provocan importantes molestias y deben ser drenados por motivos diagnósticos y terapéuticos para el manejo de los síntomas37. Debido a que estos fluidos malignos contienen células tumorales, ofrecen otro formato de muestra potencial para pruebas de respuesta a fármacos mínimamente invasivas. Después de los protocolos estándar de enriquecimiento de células tumorales (Métodos), estas muestras a menudo producen una cantidad significativa de células para la medición. Por ejemplo, en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado, una muestra de 150 ml de derrame pleural maligno arrojó casi 170 millones de células tumorales, más que suficientes para realizar pruebas de respuesta masiva para un panel de fármacos (Fig. 7d). Este paciente había estado en tratamiento con capmatinib debido a una mutación confirmada de omisión del exón 14 de MET, pero no había respondido a esta terapia en el momento de la recolección del derrame. Las medidas de respuesta masiva recopiladas en las células tumorales aisladas de la muestra de efusión fueron consistentes con este resultado clínico, y no revelaron una respuesta masiva significativa a capmatinib en dosis que oscilaron en múltiples órdenes de magnitud. Sin embargo, estas células generalmente no respondieron a todos los tratamientos, mostrando respuestas masivas significativas y dependientes de la dosis de magnitudes variables a terapias que incluyen paclitaxel, docetaxel y cisplatino (Fig. 7e y Fig. 10a complementaria). De acuerdo con las mediciones de líneas celulares de taxanos de acción más lenta, incluidos paclitaxel y docetaxel, las respuestas masivas detectadas para estos medicamentos no fueron observables con las mediciones de viabilidad basadas en citometría de flujo recopiladas para este mismo espécimen (Figura complementaria 10b). Estos resultados demuestran la viabilidad de recopilar medidas de respuesta de masa con muestras de fluidos malignos y proporcionan un ejemplo de la heterogeneidad de la respuesta a fármacos que puede revelarse midiendo directamente las células tumorales primarias. Además, demuestran el potencial de este nuevo enfoque para complementar los biomarcadores genómicos existentes que, como en el caso de este paciente, no siempre identifican una terapia eficaz.

El flujo de trabajo que se presenta aquí se basa en los esfuerzos recientes en medicina funcional de precisión para el cáncer10,11,12,13,14,15,16,17 y ofrece desarrollos traslacionales adicionales clave hacia una guía de terapia rápida ampliamente aplicable para la atención clínica del cáncer. Hemos demostrado la viabilidad de recopilar medidas de respuesta a fármacos en formatos de muestras citodiluidas y mínimamente invasivas que se utilizan para obtener muestras de tumores sólidos como FNA y fluidos malignos, además de las que se utilizan comúnmente en el estudio de neoplasias malignas hematológicas, incluida la sangre y la médula ósea. . Las mejoras técnicas descritas aquí, incluida la clasificación de imágenes para la selección de medidas y el enfoque estadístico, ayudan a identificar las respuestas al tratamiento utilizando un número limitado de células de una muestra primaria heterogénea y lábil. La reducción del ruido de fondo en las muestras primarias que permiten estos avances también sirve para acortar el tiempo de respuesta de la prueba a 2 días al limitar la duración de la exposición al fármaco necesaria para observar la respuesta.

Además de demostrar una amplia utilidad en varios tumores malignos y formatos de muestras, también hemos demostrado que este flujo de trabajo se puede utilizar para identificar respuestas masivas para una amplia gama de terapias. A pesar de los mecanismos de acción únicos y los diferentes efectos sobre las propiedades biofísicas celulares, las mediciones de masa de una sola célula pudieron identificar respuestas dependientes de la dosis en líneas celulares para todas las principales clases de fármacos probadas aquí. Además, con pocas excepciones, estas respuestas masivas fueron observables dentro de las 24 h, a menudo antes de que se pudiera detectar una señal significativa con mediciones alternativas basadas en la viabilidad. Para fármacos de acción excepcionalmente lenta, como el antimetabolito 5-fluorouracilo, aunque la respuesta masiva no fue observable hasta aproximadamente 48 h después del tratamiento, esto precedió a cualquier cambio observable en la viabilidad celular según lo evaluado por citometría de flujo (Figura complementaria 9c). Juntos, estos resultados sugieren que las mediciones de respuesta de masa ofrecen un grado de generalización a la par con los ensayos de respuesta a fármacos basados ​​en la viabilidad estándar de oro existentes al tiempo que permiten una lectura de respuesta más rápida en muchos contextos, un conjunto esencial de características cuando se caracterizan muestras clínicas heterogéneas que pueden estar experimentando una rápida deriva fenotípica ex vivo38,39.

Al igual que con otros enfoques de medición de la respuesta a los medicamentos, existen ciertas limitaciones en el uso de la respuesta masiva para una guía rápida de la terapia. Por ejemplo, debido a los enfoques de dosificación de fármacos y aislamiento de células tumorales utilizados en este flujo de trabajo, está optimizado para caracterizar fármacos con mecanismos de acción intrínsecos a las células tumorales. Las terapias que actúan principalmente a través de medios intrínsecos no celulares, como los fármacos antiangiogénicos que requieren una remodelación fisiológica (p. ej., bevacizumab) o las terapias endocrinas que se dirigen indirectamente a los cánceres con receptores hormonales positivos (p. ej., los inhibidores de la aromatasa), actualmente son incompatibles con este flujo de trabajo. . Sin embargo, ciertos tipos de terapia, incluidos los medicamentos inmunooncológicos como los inhibidores de puntos de control, pueden requerir una alteración menos significativa de la tubería para implementar mediciones efectivas de la respuesta a los medicamentos. A pesar de que estas terapias actúan a través de mecanismos intrínsecos de células no tumorales, el trabajo anterior ha demostrado que la masa de células individuales también proporciona una lectura del estado funcional de las células inmunitarias21,22. El flujo de trabajo que se presenta aquí es susceptible de la medición directa de estos efectos farmacológicos intrínsecos de las células inmunitarias.

La naturaleza unicelular de esta tubería de medición de masas ofrece oportunidades técnicas adicionales en el futuro. Por ejemplo, aquí se utilizaron imágenes vinculadas para la clasificación de partículas y la mejora de la calidad de los datos de medición de masas, pero el acceso óptico que ofrece esta plataforma es compatible con enfoques adicionales de lectura de células individuales vinculadas, incluido el análisis de imágenes de campo claro para la extracción de características o la detección de fluorescencia para la inmunofenotipificación. . En combinación con los avances en el manejo de fluidos, estas mejoras ópticas pueden conducir a requisitos de número de células más bajos para versiones futuras del ensayo. Como método no destructivo, estas mediciones de masa de una sola célula también se pueden recopilar aguas arriba de lecturas moleculares unicelulares multiómicas vinculadas, como se ha demostrado anteriormente con scRNA-seq22 emparejado. De manera similar, las mediciones de respuesta de masa recopiladas para una muestra de tumor primario se pueden usar para complementar los resultados genómicos recopilados para el mismo paciente, ya sea simultáneamente para mejorar la precisión predictiva o aguas abajo para seleccionar el inhibidor óptimo para una alteración genómica determinada. En cualquier caso, las mediciones de la masa de una sola célula ofrecen una evaluación funcional de la respuesta terapéutica para analizar aún más los determinantes biológicos subyacentes de la sensibilidad a los medicamentos, lo que ofrece importantes beneficios potenciales tanto para la toma de decisiones clínicas como para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer.

Como prueba funcional dirigida a una amplia gama de tumores malignos y mecanismos farmacológicos, este enfoque presenta desafíos únicos. Por ejemplo, el alcance de la posible prueba de respuesta a fármacos para una muestra primaria determinada depende en gran medida de la cantidad total de células tumorales disponibles después del procesamiento. Como se puede ver en la Fig. 7 y la Fig. 11 complementaria, el número de condiciones analizadas puede oscilar entre uno y más de 25. Este rendimiento celular es muy variable entre los formatos de muestra y las muestras individuales y es una consideración importante al diseñar paneles de fármacos para prueba para varios tipos de muestras. Las células tumorales aisladas de especímenes primarios también pueden tener una pureza y viabilidad muy variables entre diferentes muestras, otra consideración clave para implementar este flujo de trabajo clínicamente (Nota complementaria 1).

La interpretación de los datos de respuesta masiva recopilados para estos especímenes primarios también es un enfoque clave del desarrollo de este enfoque a medida que se traslada a la clínica. Si bien aquí nos hemos centrado en una evaluación binaria simple de respuesta y falta de respuesta basada en una comparación de distancia estadística, el trabajo futuro se centrará en el valor de considerar la magnitud de la respuesta u otras características de distribución de masa de una sola célula para capturar la profundidad o la durabilidad. de respuesta clínica. Se requieren conjuntos de datos de validación apropiados al contexto para garantizar que la prueba identifique correctamente la respuesta y la falta de respuesta clínicamente relevantes. Estas especificaciones de límite de decisión específicas para el fármaco y la malignidad son el foco de múltiples estudios prospectivos en curso sobre la leucemia mieloide aguda, el mieloma múltiple y los tumores sólidos, incluido el cáncer de mama y de pulmón (NCT04985357 y NCT03777410). El trabajo que se muestra aquí ha permitido la incorporación de esta prueba en un flujo de trabajo sólido y escalable certificado por CLIA para estos y futuros estudios de validación clínica.

Esta demostración de viabilidad clínica, además de las propiedades fundamentales de las mediciones de respuesta masiva (utilidad agnóstica de fármacos y neoplasias malignas, compatibilidad con un tamaño de muestra pequeño y tiempo de respuesta rápido) representa un paso significativo hacia el amplio impacto clínico de una prueba funcional en el paciente. cuidado.

Utilizamos la tecnología SMR para realizar mediciones unicelulares de forma similar a lo que se presentó anteriormente23,28, a caudales superiores a 80 nl/s y con una precisión de masa inferior a 0,5 pg. A diferencia de los estudios anteriores, la configuración de medición utilizada para este estudio es un instrumento integrado que controla el sensor SMR y la fluídica asociada. Se utilizaron trece instrumentos SMR idénticos para recopilar los datos presentados en este documento. Cada instrumento está equipado con una configuración de control de fluidos basada en la presión y el flujo, un controlador de temperatura para mantener el chip SMR estable a temperatura ambiente, un controlador FPGA junto con una lectura personalizada y electrónica de accionamiento para controlar el sensor SMR y registrar datos similares a ese descrito en Olcum et al.40, una unidad de imagen para capturar imágenes de células individuales a medida que fluyen a través del SMR y una computadora para ejecutar el software de control y análisis. El SMR y las subunidades del prototipo están controlados por un software personalizado desarrollado en el entorno LabView. El software guía automáticamente al técnico a través de los pasos de calibración, cebado de fluidos, medición de celdas y pasos de limpieza secuencialmente. El paso de limpieza se realiza entre cada condición de fármaco medido para evitar la contaminación entre las mediciones. La configuración y los parámetros de las mediciones de los instrumentos son idénticos en todos los instrumentos SMR y el software de control los extrae de un servidor local. Además, el software de control está equipado con rutinas automáticas, como retroceso del flujo para evitar obstrucciones, carga automática de muestras para minimizar el desperdicio y rutinas de limpieza para aumentar la velocidad y la confiabilidad.

En este trabajo, utilizamos la distancia del motor terrestre (EMD), también conocida como la primera distancia de Wasserstein, para cuantificar la diferencia de distribuciones de masa como "respuesta de masa". EMD posee las propiedades de una métrica ideal para cuantificar las diferencias en las distribuciones celulares41, como la linealidad, la invariancia de la traducción, la simetría, y es resistente a las pequeñas diferencias de distribución debidas a la deriva del instrumento, el ruido de medición u otras fuentes de variabilidad42. Como sugirieron Orlova et al.42, EMD cumple con todos los requisitos mencionados anteriormente y es computacionalmente eficiente para ejecutar datos unidimensionales como las mediciones de masa de una sola célula43.

Para definir la señal de respuesta de masa como una métrica adimensional normalizada para comparar distribuciones de masa, introducimos la siguiente notación (Ec. 1):

donde X y Z son mediciones de masa de células individuales ordenadas de células de referencia tratadas con fármaco y vehículo, respectivamente, y \(N\) es el número de células en cada distribución42. (La respuesta de masa también se calcula para instancias donde X y Z tienen diferentes tamaños. En la ecuación anterior, asumimos N para ambos por simplicidad).

Calculamos el intervalo de confianza del 90 % de la señal de respuesta de masa utilizando métodos de arranque no paramétricos, ya que no podemos esperar distribuciones gaussianas (u otras conocidas) para la masa celular. Específicamente, el método BCa (parcialmente corregido y acelerado) se utiliza para estimar intervalos de confianza con probabilidades de cobertura precisas en todo el rango de señal de respuesta de masa44. Para todas las respuestas masivas informadas en este documento, \(N=2500\) celdas y el número de réplicas de arranque para el intervalo de confianza de respuesta masiva es \(R=5000\) a menos que se indique explícitamente lo contrario.

La estructura propuesta para medir la respuesta de masa (Fig. 2c, d) nos permite probar la importancia biológica de la señal de respuesta de masa medida en lugar de comparar directamente las mediciones de una sola célula mediante una prueba estadística. Dado que el número de células medidas (\(N\)) para representar cada población de células es del orden de miles, las pequeñas desviaciones en las distribuciones de masa debidas a errores de muestreo, ruido del instrumento o deriva fenotípica pueden resultar estadísticamente significativas. Tales desviaciones, sin embargo, pueden ser estadísticamente significativas sin representar una señal biológicamente significativa45. Para sortear este problema, definimos la estadística de prueba, \(\theta\), como la diferencia entre dos señales de respuesta de masa, es decir, CTRL y TEST, como se muestra en la Fig. 2d, y comprobamos si \(\theta\) es mayor que el límite del umbral de decisión. Por lo tanto (Ec. 2):

donde \(Y\) son las medidas de masa ordenadas de las células de control tratadas con vehículo y \(X\) y \(Z\) se definen como anteriormente. El segundo término de la ecuación es la distancia entre las celdas de referencia y de control medida en diferentes puntos en el tiempo (Fig. 2c). La estadística de prueba es, por tanto, la distancia de las células tratadas con fármaco a las células de referencia tratadas con vehículo en relación con la "desviación fenotípica" (si la hay) en las células de control durante la duración de la prueba. Incluso en ausencia de deriva, el segundo término captura el ruido natural inherente a la estimación de la distancia entre dos muestras finitas de la misma distribución.

Para evaluar la sensibilidad de las células cancerosas al tratamiento, comparamos la señal, \(\theta\), con un umbral, \({\theta }_{0}\), el "límite de decisión" biológicamente significativo, apropiado para el clase de fármaco que se está evaluando. En general, es un desafío hacer pruebas de hipótesis no paramétricas para valores nulos distintos de cero. Como afirmó Chernick, "Particularmente importante en la prueba de hipótesis es el uso de estadísticas pivotales asintóticamente y centrar la distribución bajo la hipótesis nula"46. De acuerdo con la declaración, usamos el método bootstrap-t como se describe aquí. Usando la derivación de Davison et al.29, introducimos un pivote, es decir, una combinación de datos y parámetros cuya distribución es independiente de un modelo subyacente (Ec. 3),

donde \(\hat{\theta }\) es la señal observada, \(\theta\) es la señal verdadera (no observable), y \(S\) es el error estándar de \(\hat{\theta }\ ). En esta formulación, \(T\) es asintóticamente gaussiana. En el trabajo presentado aquí, \(\hat{\theta }\) se mide a partir de \(N=2500\) células de cada una de las poblaciones de referencia, de control y de prueba. \(S\) se estima utilizando \(r=19\) replicantes de arranque de \(\hat{\theta }\).

Para probar la hipótesis nula \({H}_{0}:\theta \le {\theta }_{0}\), sustituimos \({\theta }_{0}\) por \(\theta\ ) y el valor observado del pivote bajo el nulo se convierte en (Ec. 4):

Para hacer la prueba de hipótesis, comparamos \({t}_{{{{{{\mathrm{obs}}}}}}}}\) con una simulación de arranque de \(T\) (Ec. 5) :

donde S* es el error estimado del replicante bootstrap, \({\hat{\theta }}^{* }\). Dado que \({S}^{* }\) es, nuevamente, encontrado por bootstrap, tenemos un método de "bootstrap incrustado". Usamos \(R=\,999\) iteraciones de \({\hat{\theta }}^{* }\) y, para cada una de ellas, \(r=\,19\) iteraciones para estimar \( {S}^{*}\).

El valor de \(p\), es decir, la probabilidad de lograr el resultado observado dado que la hipótesis nula es verdadera, es entonces (Ec. 6):

donde \(\Pr \left(x\right)\) es la probabilidad de que \(x\) sea verdadera y \(\#[{x}^{* }]\) es el recuento de variantes de arranque para las que \ (x\) es verdadero. Para el número elegido de iteraciones, \(R\), el valor mínimo alcanzable de \(p\) es 0,001. Comparamos el valor \(p\) resultante con el nivel de significación habitual del 5 %, es decir, \(p\,{{{{{\rm{valor}}}}}} \, < \, 0,05\), para determinar si se puede rechazar la hipótesis nula.

Las imágenes recopiladas de varios tipos de células en los instrumentos SMR se seleccionaron manualmente para generar conjuntos de entrenamiento de al menos 10 000 imágenes para cada clase de imagen (célula intacta, célula permeable, desechos y agregados). Luego se generaron tres modelos CNN de clasificación binaria diferentes utilizando la biblioteca Keras (2.3.1) en Python (3.7.7). Estos incluyen (1) un modelo de aceptación/rechazo que utilizó imágenes de células intactas y permeables como eventos "aceptados" e imágenes de desechos y agregados como eventos "rechazados" durante el entrenamiento, (2) un modelo intacto/permeable y (3) un modelo de agregados/escombros. Para el entrenamiento, usamos el aumento de imágenes para mejorar la solidez de los modelos finales. Este aumento incluía volteo aleatorio de imágenes verticales y horizontales, ajuste de brillo y rotación. Cada modelo se entrenó usando el 90 % de las imágenes de cada conjunto de entrenamiento seleccionado, y el 10 % restante se usó para la validación cruzada para probar el rendimiento del modelo. La precisión y el recuerdo de esta validación cruzada se informan en la Fig. 3. Las imágenes se clasificaron en dos etapas, primero utilizando el clasificador de aceptación/rechazo y luego anotando las partículas aceptadas con el clasificador intacto/permeable y las partículas rechazadas con el clasificador de desechos/rechazo. agregar.

Las células A549, PC9, MDA-MB-361, PA-TU-8902, HT-29, NCI-H1666, NCI-H2228, MM.1S, MM.1R, H929, U266 y KMS-12-PE se mantuvieron en un medio base suplementado con suero bovino fetal (FBS; Sigma Aldrich, n.° de cat. F4135), antibiótico-antimicótico (Gibco, n.° de cat. 15240062) y HEPES (Gibco, n.° de cat. 15630080), y almacenado en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO2. El medio base era RPMI1640 + GlutaMAX (Gibco, n.° de catálogo 61870), DMEM + glucosa + GlutaMAX (Gibco, n.° de catálogo 10566024) o medio 5A de McCoy (ATCC, n.° de catálogo 302007). Las células H929 se cultivaron en medios suplementados con 2-mercaptoetanol (Sigma, Cat#97622). Para el paso, las líneas celulares adherentes se trataron con tripsina-EDTA al 0,25 % (Gibco, Cat#25200) según lo recomendado por el fabricante. Las líneas celulares se obtuvieron de ATCC, DSMZ o ECACC, excepto las células KMS-12-PE, que se recibieron como parte de una colaboración con Parekh Lab en MSSM. Todas las líneas celulares dieron negativo para micoplasma mensualmente.

Los medicamentos se obtuvieron de MedChemExpress o SelleckChem como polvos liofilizados y se reconstituyeron en un solvente apropiado y se almacenaron como alícuotas de un solo uso a -80 ˚C para uso a largo plazo. Para los ensayos de respuesta masiva, las células se dosificaron a 2 × 105 células/mL y se dosificaron a las concentraciones de fármaco determinadas durante la duración especificada. Las células de control se dosificaron con 0,25% de DMSO (control de vehículo). A continuación, las células se sembraron en placas de poliestireno estándar de 6 o 12 pocillos y se incubaron durante el período especificado. Para las líneas celulares en suspensión, en el momento de la medición, las células se resuspendieron suavemente, se enjuagaron con un medio completo, se centrifugaron durante 5 min a 300 × g y se resuspendieron en un medio para la medición. Para las células de líneas celulares adherentes, en el momento de la medición, se recogió el sobrenadante de cada pocillo, se enjuagó el pocillo con PBS y se separaron las células usando EDTA-tripsina al 0,25 % (Gibco, Cat#25200) durante 7 min. A continuación, las células separadas se combinaron con el sobrenadante de cada pocillo, se centrifugaron durante 5 min a 300 × g y se resuspendieron en el medio para la medición. Las células primarias aisladas se sembraron en placas de unión baja de 24 o 96 pocillos (Corning: Cat# 3473), y después de la incubación, las células se resuspendieron suavemente, se enjuagaron con medio completo, se centrifugaron durante 5 min a 300 × g y se resuspendieron en un medio para medir.

Se recolectaron muestras de cáncer primario de los pacientes con consentimiento informado y de conformidad con los protocolos aprobados por el IRB (WCMC IRB n.° 0010004608, ISMMS IRB n.° STUDY-18-00456, CSHRI IRB n.° 1738582-3). Una vez que se recolectó la muestra primaria, el transportista fue enviado durante la noche de regreso al laboratorio de Travera para su procesamiento. Todas las muestras de fluido maligno y FNA se enviaron en cargadores que mantenían 4 ˚C (FedEx, unidad de enfriamiento de duración estándar). Los aspirados con aguja fina se resuspendieron en HypoThermosol (BioLife Solutions) para su conservación durante el envío. Las muestras de sangre y médula ósea se colocaron en tubos de muestras clínicas con heparina sódica de tapa verde (BD Vacutainer) y se enviaron en contenedores a temperatura ambiente controlada que mantenían temperaturas entre 15 y 20 °C (Inmark Life Sciences). Cada remitente se preparó de otro modo de acuerdo con las reglamentaciones para un envío de categoría B de sustancias biológicas.

Las muestras de sangre y médula ósea se procesaron mediante filtración aguas arriba a través de un filtro de malla de 70 µm (pluriSelect), seguido de centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Sigma Aldrich). A continuación, las poblaciones de células mononucleares se sometieron a selección positiva utilizando microesferas magnéticas CD138+ o CD33+ (Miltenyi) y se separaron utilizando un separador AutoMACS Pro (Miltenyi) siguiendo los protocolos del fabricante. Las células purificadas se resuspendieron en medio RPMI complementado con Glutamax y FBS al 10 %. Las muestras de aspirado con aguja fina se sometieron primero a lisis de glóbulos rojos (BD PharmLyse), seguido de digestión mecánica y enzimática utilizando el kit de disociación de tumores humanos Miltenyi siguiendo el protocolo del fabricante. A continuación, las células tumorales se purificaron utilizando el kit de aislamiento de células tumorales humanas Miltenyi siguiendo el protocolo del fabricante. De manera similar, las muestras de derrame pleural se sometieron primero a lisis de glóbulos rojos seguida de aislamiento de células tumorales basado en MACS utilizando el mismo kit de aislamiento de células tumorales Miltenyi. Tanto para muestras de FNA como de efusión, las células tumorales enriquecidas se resuspendieron en medio DMEM con Glutamax y FBS al 20 %.

La respuesta de viabilidad de las células se evaluó usando CellTitre-Glo 2.0 (Promega, Cat#G9242) y la luminiscencia se cuantificó mediante un lector de placas. Las células se sembraron por triplicado en una placa de 96 pocillos de fondo plano (Corning, Cat#3903) a concentraciones iniciales de 2 × 104 o 2 × 105, según el tiempo de duplicación celular. Los tratamientos farmacológicos se evaluaron entre 24 y 144 h. Todas las mediciones se realizaron según el protocolo del fabricante.

Todas las mediciones de citometría de flujo se realizaron en un citómetro MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). El análisis de datos se realizó con FlowJo (10.8.1). La viabilidad celular se evaluó tiñendo las células con anexina V (Biolegend, CAT# 640945) y 4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato (DAPI) (Biolegend, CAT# 422801), las células viables se definieron como células con tinción negativa para tanto DAPI como Anexina V. Para comparar los datos de citometría de flujo con los datos de masa (Fig. 5 y Fig. 9 complementaria), se tomaron muestras aleatorias de subconjuntos de 2500 células de cada conjunto de datos de citometría de flujo 1000 veces para definir un intervalo de confianza del 95 % para la viabilidad celular lecturas Luego, estas mediciones se compararon con la condición de control utilizando un límite de decisión del 3% (descrito anteriormente para mediciones de respuesta de masa) para determinar los valores de p. Para comparar fielmente la magnitud de la respuesta entre la citometría de flujo y las lecturas de masa, se determinó el límite del eje y para las mediciones de respuesta de masa al encontrar la respuesta de masa entre eventos de imagen clasificados como "Células" versus "Permeables" dentro de la población de control de células medidas para cada experimento como un representante de la pérdida de viabilidad del 100% según lo determinado por citometría de flujo (Fig. 4 complementaria).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Todos los datos de origen para las cifras se pueden encontrar en Datos complementarios 1.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04376-8

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Los autores desean agradecer a Scott Manalis y Keith Ligon por sus comentarios y debates útiles. Este trabajo fue respaldado por la Fase I NCI SBIR 1R43CA228872-01A1 y la Fase II NSF SBIR 2026060. Las figuras se generaron utilizando BioRender.com.

Estos autores contribuyeron igualmente: Robert J. Kimmerling, Mark M. Stevens, Selim Olcum.

Estos autores contribuyeron igualmente: Anthony Minnah, Madeleine Vacha, Rachel LaBella.

Travera, Medford, MA, EE. UU.

Robert J. Kimmerling, Mark M. Stevens, Selim Olcum, Anthony Minnah, Madeleine Vacha, Rachel LaBella, Matthew Ferri, Steven C. Wasserman y Clifford A. Reid

Departamento de Investigación Clínica, Dignity Health, Sequoia Hospital, Redwood City, CA, EE. UU.

Juanita Fujii, Zayna Shaheen y Srividya Sundaresan

Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Drew Ribadeneyra, David S. Jayabalan, Ruben Niesvizky y Cara A. Rosenbaum

Departamento de Medicina, Hematología y Oncología Médica, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Sarita Agte, Adolfo Alemán y Samir Parekh

Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Sarita Agte, Adolfo Alemán y Samir Parekh

Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Adolfo Alemán

Departamento de Oncología Médica, Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Joseph A. Criscitiello y Marlise R. Luskin

Instituto de Inmunología de Precisión, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Samir Parek

Departamento de Ciencias Oncológicas, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Samir Parek

División de Radiología Vascular e Intervencionista, Fundación Médica de Palo Alto, Redwood City, CA, EE. UU.

Anobel Tamrazi

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RJK, MMS, SO, MV, AM, RL y CAR definieron la estrategia de investigación y diseñaron los experimentos. RJK, AM, MV y RL realizaron experimentos. RJK, MMS, SO, AM, MV, RL y MF realizaron análisis de datos. RJK, MMS, SO y SCW implementaron el hardware y el software de la plataforma. JF, ZS, SS, DR, DJ, SA, AA, JAC, RN, MRL, SP, CAR y AT administraron la recolección y el envío de muestras clínicas, incluida la identificación del paciente, el consentimiento del paciente, la recolección y empaque de muestras para el envío y la anotación clínica del paciente. . RJK, MMS y SO prepararon las cifras y escribieron el manuscrito, con comentarios de todos los autores.

Correspondencia a Robert J. Kimmerling o Clifford A. Reid.

RJK, MMS, SO y CAR son fundadores de Travera, que comercializa tecnología SMR para uso clínico. RJK, MMS, SO, AM, MV, RL y CAR son empleados de Travera. MF, SW y AT reciben honorarios de consultoría de Travera. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Toril Holien y Gene Chong. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Kimmerling, RJ, Stevens, MM, Olcum, S. et al. Una tubería para la evaluación independiente de la malignidad y la terapia de la respuesta a los medicamentos contra el cáncer utilizando mediciones de masa celular. Comun Biol 5, 1295 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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Recibido: 01 junio 2022

Aceptado: 16 noviembre 2022

Publicado: 26 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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