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Dec 16, 2023

Las partículas magnéticas de hidrogel mejoran la secuenciación de nanoporos del SARS

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2163 (2023) Citar este artículo

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Aquí se presenta un flujo de trabajo habilitado para partículas de hidrogel magnético para capturar y concentrar el SARS-CoV-2 a partir de muestras de hisopos remanentes de diagnóstico que mejora significativamente los resultados de la secuenciación utilizando la plataforma de secuenciación MinION de Oxford Nanopore Technologies. Nuestro enfoque utiliza una nueva partícula de hidrogel magnético basada en la afinidad, eludiendo los bajos volúmenes de muestra de entrada y permitiendo flujos de trabajo de alto rendimiento manuales y automatizados rápidos que son compatibles con la secuenciación de Nanopore. Este enfoque mejora los protocolos de extracción de ARN estándar, proporcionando mejoras de hasta 40 veces en las lecturas mapeadas virales y mejora la cobertura de secuenciación en un 20-80 % a partir de muestras remanentes de diagnóstico de títulos más bajos. Además, demostramos que este enfoque funciona para muestras artificiales de virus de la influenza y virus sincitial respiratorio, lo que sugiere que puede usarse para identificar y mejorar los resultados de secuenciación de múltiples virus en muestras de VTM. Estos métodos se pueden realizar manualmente o en una plataforma de automatización KingFisher.

Hasta el 10 de abril de 2022, ha habido más de 500 millones de casos de COVID-19 y casi 6,2 millones de muertes relacionadas con COVID-19 en todo el mundo1. Las mutaciones virales han permitido que la pandemia impregne la vida cotidiana a pesar del uso de medidas sanitarias globales generalizadas para prevenir la propagación del SARS-CoV-2. La detección y el seguimiento de las variantes virales emergentes se han convertido en herramientas fundamentales en la respuesta sanitaria mundial, lo que pone de relieve la necesidad de métodos de secuenciación precisos y de despliegue rápido2,3,4,5. Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) han hecho que el uso rutinario de la secuenciación para monitorear e identificar brotes virales sea más posible, pero muchos instrumentos NGS no son portátiles y aún tienen un costo prohibitivo, lo que limita su adopción general6,7. La plataforma MinION de Oxford Nanopore Technologies (ONT) ofrece una estrategia de detección portátil y relativamente económica, que es capaz de identificar y secuenciar varios virus respiratorios en el campo8,9,10.

Si bien los avances en la secuenciación hacen posible la detección y caracterización rápidas en el sitio del SARS-CoV-2 y otros genomas virales, estos secuenciadores portátiles todavía están limitados por ciertas desventajas, a saber, que a menos que se usen grandes cantidades de ARN viral para las reacciones de secuenciación, no hay pueden ser problemas de precisión durante la llamada base11,12,13,14,15,16. Estas limitaciones técnicas reducen la utilidad de una herramienta que podría mejorar la capacidad de responder de manera rápida y precisa a los brotes virales y rastrear la transmisión en tiempo real.

El aumento de la cantidad total de material de ARN para el análisis a través del enriquecimiento de la muestra es una estrategia disponible para mejorar el rendimiento de las plataformas de secuenciación. Con este fin, buscamos abordar las limitaciones de secuenciación viral de un secuenciador de nanoporos aplicando la tecnología de enriquecimiento de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) basada en afinidad a muestras de medio de transporte viral (VTM) de SARS-CoV-2. En resumen, las partículas de hidrogel magnético mejoran el rendimiento del ensayo al facilitar la unión rápida del analito (p. ej., viriones intactos) de grandes volúmenes de muestra y al reducir la presencia de sustancias que interfieren en los ensayos posteriores. Las partículas de hidrogel capturan y concentran analitos de interés utilizando moléculas pequeñas, como colorantes de afinidad, que se inmovilizan en un marco de cadenas de polímeros reticulados. Estas pequeñas moléculas se unen a sus objetivos (por ejemplo, las proteínas de la superficie del virión), a menudo con una afinidad muy alta, a través de una combinación de interacciones electrostáticas e hidróficas. Una vez unidos a la partícula de hidrogel magnético, los viriones se pueden concentrar y eliminar de la matriz de la muestra mediante un simple paso de separación magnética. Después de la concentración, los viriones se unen fuertemente al tinte de afinidad de partículas de hidrogel y los ácidos nucleicos virales no están disponibles para el análisis molecular. Como tal, se usa un kit de extracción de ácido nucleico para lisar los viriones y purificar los ácidos nucleicos virales en preparación para un ensayo molecular posterior. La tecnología de partículas Nanotrap ha mostrado una amplia aplicación en el diagnóstico clínico al enriquecer y estabilizar biomarcadores y analitos en muestras clínicas complejas. Estudios recientes demostraron este proceso de concentración y extracción, mostrando que las partículas de hidrogel magnético pueden concentrarse y mejorar la detección de muchos tipos virales, incluido el SARS-CoV-2, en múltiples ensayos moleculares17,18,19,20,21.

Cuando se utiliza una plataforma de secuenciación portátil como el secuenciador ONT MinION, aumentar la cantidad de ARN de entrada debería permitir la secuenciación exitosa de muestras virales de títulos más bajos, lo que, a su vez, aumenta potencialmente la fracción de muestras de pacientes que son viables para la secuenciación. Idealmente, esto debería mejorar la identificación de mutaciones virales específicas, acelerando la respuesta a variantes problemáticas emergentes22,23,24.

Aquí, mostramos que las partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) pueden mejorar los flujos de trabajo de secuenciación actuales y habilitar otros nuevos al mejorar los métodos de extracción de ARN estándar actuales. Demostramos que estos flujos de trabajo de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) mejoran los resultados de secuenciación al aumentar el total de lecturas mapeadas virales, lo que resulta en una mayor profundidad y cobertura de secuenciación. Los flujos de trabajo de partículas Nanotrap se desarrollaron para múltiples kits de extracción de ARN, y su utilidad se demuestra tanto en muestras remanentes artificiales como de diagnóstico.

Las partículas magnéticas de virus Nanotrap (SKU: 44,202) fueron proporcionadas por Ceres Nanosciences Inc. Manassas, VA.

Las muestras artificiales se componían de virus inactivados por calor añadidos a VTM (Puritan UniTranz-RT Transport Systems, n.° de cat. 89,233–458). Se generaron 5 concentraciones (106, 105, 104, 103 y 102 TCID50/mL) comenzando con una muestra pura de VTM enriquecida a 106 TCID50/mL del stock viral, se realizaron cuatro diluciones en serie 1:10 hasta una concentración de 102 TCID50/ml utilizando VTM puro como tampón de dilución. La concentración inicial de reserva viral se basó en la concentración informada por el fabricante. Los virus inactivados por calor se adquirieron de ZeptoMetrix: SARS-CoV-2 (n.° de cat. 0810587CFHI), influenza A-H1N1 (n.° de cat. 0810109CFHI) y virus respiratorio sincitial tipo A (RSV) (n.° de cat. 0810040ACFHI).

Las muestras remanentes de diagnóstico positivas para SARS-CoV-2 en medio de transporte viral se compraron en Discovery Life Sciences, Huntsville, AL. Discovery Life Sciences probó previamente estas muestras mediante RT-PCR, obteniendo umbrales de ciclo que van de 24 a 35. Las muestras adquiridas de Discovery Life Sciences siguen el "Acuerdo de compra de muestras biológicas" y se anulan con la siguiente generación de datos que se adhiere a sus pautas de identificación, permitiendo el uso de tales muestras para investigación y publicación, incluyendo qPCR y secuenciación.

Flujo de trabajo de partículas Nanotrap 1 (Método de partículas de hidrogel magnético manual con kit de extracción de ARN basado en columna): Se agregaron doscientos microlitros de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) a una concentración de 5 mg/mL a muestras de VTM de 1000 µL. La cantidad de partículas Nanotrap utilizadas se basó en experimentos anteriores de optimización de captura de virus17,18,19,20,21. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se colocaron en un separador magnético durante 2 minutos para permitir que las partículas de Nanotrap sedimentaran. Los sobrenadantes se retiraron y desecharon. Se agregaron cien microlitros de agua libre de ARNasa/ADNasa con 350 µL de QIAGEN Buffer RLT al sedimento de partículas Nanotrap. Las muestras se incubaron durante 10 minutos en un agitador a temperatura ambiente antes de colocarlas en un separador magnético durante 2 minutos para permitir que las partículas de Nanotrap sedimenten. Los sobrenadantes que contenían el material de ácido nucleico viral se procesaron para la extracción de ARN utilizando el kit de limpieza RNeasy MinElute de QIAGEN (n.° de catálogo 74.204) siguiendo las instrucciones de flujo de trabajo de 100 µL del fabricante. Después de la extracción de ARN, las muestras de ARN estaban listas para la preparación de la biblioteca de secuenciación.

Nanotrap Particle Workflow 2 (Método de partículas de hidrogel magnético manual con kit de extracción de ARN basado en microesferas magnéticas): se agregaron 300 microlitros de PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v) directamente a muestras de VTM de 500 µl. Se agregaron doscientos microlitros de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) a cada muestra de VTM, que luego se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. La cantidad de partículas Nanotrap utilizadas para estos experimentos se basó en flujos de trabajo de captura de virus exitosos anteriores y se optimizó en términos de rendimiento y costo17,18,19,20,21. Las muestras se colocaron en un separador magnético durante 2 minutos para permitir que las partículas de Nanotrap sedimentaran. Los sobrenadantes se retiraron y desecharon. Los sedimentos de partículas de nanotrampa se resuspendieron en 1 ml de agua de grado molecular con Tween-20 al 0,05 % (v/v). Después de una breve resuspensión, las muestras se colocaron nuevamente en un separador magnético durante 2 minutos para permitir que las partículas de Nanotrap sedimentaran, y el sobrenadante se eliminó y se desechó. Las partículas de nanotrampa se resuspendieron en 200 µl de solución de lisis de microbioma MagMAX y las muestras se incubaron a 65 °C en un agitador durante 10 min. Luego, las muestras se colocaron en un separador magnético para permitir que las partículas de Nanotrap sedimentaran durante 2 minutos. Los sobrenadantes que contenían el material de ácido nucleico viral se sometieron a extracción de ARN utilizando el kit de aislamiento de ácido nucleico Ultra Microbiome MagMAX (n.º de cat. A42357) siguiendo las instrucciones de flujo de trabajo de 200 µL del fabricante. Después del procesamiento del kit de extracción, las muestras de ARN estaban listas para la preparación de la biblioteca de secuenciación.

Nanotrap Particle Workflow 3 (Método de partículas de hidrogel magnético automatizado con kit de extracción de ARN basado en perlas magnéticas): el siguiente método utilizó la plataforma de automatización KingFisher (KingFisher Apex) y los consumibles asociados. Se añadieron 300 microlitros de PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v) directamente a muestras de VTM de 500 µl en una placa KingFisher de 96 pocillos profundos. Se agregaron doscientos microlitros de partículas de hidrogel magnético (Nanotrap Particles) a cada muestra de VTM. La cantidad de partículas Nanotrap utilizadas para estos experimentos se basó en flujos de trabajo de captura de virus exitosos anteriores y se optimizó en términos de rendimiento y costo17,18,19,20,21. Se añadió agua de grado molecular con Tween-20 al 0,05 % (v/v) a una segunda placa de 96 DW, y se añadieron 200 µl de solución de lisis de microbioma MagMAX a una tercera placa de 96 DW. Se creó un programa KingFisher personalizado "NT2MM.kfx" para procesar las partículas Nanotrap utilizando las tres placas 96 DW preparadas. Todo el proceso se produjo en 30 min y el eluato final contenía ARN viral extraído.

Después del procesamiento de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap), similar al "Flujo de trabajo de partículas Nanotrap 2", las muestras de ARN viral extraídas se procesaron con el kit de aislamiento de ácido ultranucleico MagMAX Microbiome siguiendo las instrucciones de flujo de trabajo de 200 µL del fabricante. Para este flujo de trabajo, la extracción se automatizó en la plataforma de automatización KingFisher. Los autores consideran que Nanotrap Particle Workflow 2 y 3 son funcionalmente iguales, utilizan los mismos reactivos y condiciones de extracción, con la única diferencia apreciable de que "Nanotrap Particle Workflow 3" se lleva a cabo en la plataforma de automatización KingFisher. Después del procesamiento del kit de extracción, las muestras de ARN estaban listas para la preparación de la biblioteca de secuenciación.

Los flujos de trabajo de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) descritos anteriormente se compararon con dos flujos de trabajo de kit de extracción estándar sin partículas Nanotrap. Para la comparación del flujo de trabajo 1, las muestras se procesaron con el kit de limpieza RNeasy MinElute de QIAGEN (n.° de catálogo 74,204) siguiendo las instrucciones de flujo de trabajo de 100 µl del fabricante. Para las comparaciones de los flujos de trabajo 2 y 3, las muestras se procesaron con el kit de aislamiento de ácido ultranucleico ThermoFisher MagMAX Microbiome (n.º de cat. A42357) siguiendo las instrucciones de flujo de trabajo de 200 µl del fabricante.

El método de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) permite al usuario interrogar un volumen de entrada de muestra más grande en relación con otros métodos de extracción. Para Nanotrap Particle Workflow 1, el factor de enriquecimiento teórico es 10 × ya que nuestro método procesa 1000 µL de VTM en relación con el volumen de entrada de 100 µL de las recomendaciones del fabricante de la columna. Tenga en cuenta que, dadas las limitaciones en los volúmenes de las colecciones clínicas de VTM, restringimos los volúmenes utilizados para Nanotrap Workflow de 1 µL a 1000 µL.

Para Nanotrap Particle Workflow 2 y 3, el factor de enriquecimiento teórico es 2,5 × ya que nuestro método procesa 500 µL de VTM en relación con el volumen de entrada de 200 µL de las recomendaciones del fabricante de perlas de sílice. Para permitir la automatización, restringimos los volúmenes utilizados para Workflow 2 y 3, asegurando la compatibilidad con la plataforma de automatización KingFisher.

Para el análisis de RT-PCR de muestras de SARS-CoV-2, se utilizó el kit IDT 2019 nCoV CDC EUA (n.º de cat. 1 006 770), que incluye cebadores/sondas N1, para la RT-PCR en tiempo real. Siguiendo la recomendación de IDT, se utilizó TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix de ThermoFisher (n.º de cat. A15300) en el ensayo IDT 2019 nCoV CDC EUA. Cada reacción de PCR utilizó 8,5 µl de agua libre de nucleasas, 5 µl de solución TaqPath, 1,5 µl de cebador/sonda N1 y 5 µl de plantilla de ARN. Las condiciones de PCR se realizaron de acuerdo con las instrucciones de IDT en un Roche LightCycler 96. Todos los experimentos de SARS-CoV-2 (tanto inactivados por calor como remanentes de diagnóstico) utilizaron este ensayo.

Para el análisis de RT-PCR de muestras de influenza A y RSV, se utilizaron el kit Primerdesign Influenza A H1 (Path-H1N1-v2.0-Standard) y el kit Primerdesign RSV (Path-RSV-A-Standard) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las condiciones de PCR se realizaron de acuerdo con las instrucciones de Primerdesign en un Roche LightCycler 96.

Después de la extracción del ARN viral, las muestras se prepararon para la secuenciación utilizando el ARTIC Network desarrollado; "Protocolo de secuenciación nCoV-2019 v3 (Lo Cost)"25. Brevemente, se preparó ADNc amplificado utilizando un enfoque de amplicón dirigido. Según el protocolo ARTIC nCov-2019, se utilizaron cebadores del panel de secuenciación de amplicones IDT ARTIC V3. Estos 218 cebadores, que cubren todo el genoma del SARS-CoV-2, se usaron para generar y amplificar el ADNc del ARN viral extraído. Una vez que se preparó el ADNc, las muestras se procesaron con el kit de secuenciación de ligadura de Oxford Nanopore Technologies (ONT), con códigos de barras individuales usando los códigos de barras nativos del kit de expansión de códigos de barras nativos de ONT con un protocolo "One-pot" modificado siguiendo el "Protocolo de secuenciación nCov-2019 v3 (Lo Costo)" instrucciones. Estas muestras individuales se agruparon y concentraron utilizando perlas magnéticas AMPure XP (n.° de cat. A63880). La biblioteca agrupada se cargó en una celda de flujo ONT FLO-MIN106 R.9 utilizada con la plataforma de secuenciación ONT Mk1C. A menos que se indique lo contrario, el ONT Mk1C se ejecutó durante 24 h utilizando el kit LSK109 con los códigos de barras EXP-ND-196 seleccionados.

Para analizar y procesar los datos de secuenciación generados por la plataforma ONT Mk1C, se utilizaron las siguientes herramientas: se realizaron llamadas base y demultiplexación en vivo utilizando el software ONT MinKnow integrado en el dispositivo ONT Mk1C MinION; la clasificación general y las lecturas mapeadas virales se generaron utilizando el protocolo WIMP del 9/3/2020 a través de la herramienta web Epi2me de ONT; Se realizó un análisis de cobertura adicional utilizando Minimap2 y Samtools a través del portal web UseGalaxy.org. Se realizaron pruebas t pareadas y se generaron cifras utilizando Graphpad Prism 9. El análisis Nextclade y Pangolin se realizó a través del flujo de trabajo ARTIC SARS-CoV-2 desarrollado por EPI2ME Labs26.

Estudios anteriores han demostrado que las partículas magnéticas de hidrogel (partículas Nanotrap) capturan y concentran múltiples patógenos virales respiratorios, incluidos el SARS-CoV-2, la influenza A, la influenza B y el RSV17,18,19,20,21. Este enriquecimiento condujo a mejores resultados mediante varios ensayos moleculares, incluida la RT-PCR en tiempo real. Presumimos que si las partículas de Nanotrap podían mejorar estos ensayos moleculares, también podrían mejorar las plataformas de secuenciación al aumentar la cantidad de ARN viral disponible para la secuenciación. Para demostrar la solidez y la facilidad de uso de la tecnología de partículas Nanotrap en la secuenciación, se desarrollaron tres flujos de trabajo: un método manual con un kit de extracción de ARN basado en columnas, un método manual con un kit de extracción de ARN basado en perlas magnéticas y un método automatizado con un kit de extracción de ARN basado en perlas magnéticas.

Desarrollamos un método que utiliza hidrogel magnético (partículas Nanotrap) para capturar y concentrar viriones completos de SARS-CoV-2 seguido de una extracción de ARN basada en columnas, examinando la capacidad de las partículas Nanotrap para mejorar la secuenciación de nanoporos de SARS-CoV-2. Con ese fin, se procesaron muestras VTM artificiales de SARS-CoV-2 inactivado por calor con Nanotrap Particle Workflow 1 usando el QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit para la extracción de ARN viral ([+ NT]) o sin partículas Nanotrap usando solo el kit Rneasy ([-NT]). Las muestras de ARN extraídas se prepararon para la secuenciación utilizando el protocolo de secuenciación ARTIC nCoV-2019 y se ejecutaron en el secuenciador ONT Mk1C como se describe en la sección del método. El ARN viral extraído también se analizó con el kit IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR para identificar una posible correlación entre los dos ensayos y confirmar la presencia de SARS-Cov-2. Como se muestra en la Fig. 1A, las partículas de Nanotrap mejoraron los resultados de secuenciación en múltiples concentraciones en comparación con el flujo de trabajo sin partículas de Nanotrap. Se observó una mejora de 6,0 × en las lecturas mapeadas virales de SARS-CoV-2 a 106 TCID50/mL y una mejora de 2,0 × a 105 TCID50/mL. El análisis estadístico mostró que las mejoras fueron significativas con valores de p < 0,05 para ambas concentraciones de virus. No se observó una mejora significativa entre las muestras [+ NT] y [− NT] por debajo de 105 TCID50/mL. Cuando se realizó RT-PCR, las partículas de Nanotrap mejoraron la recuperación viral en 2 umbrales de ciclo de PCR (Cts) en las primeras cuatro diluciones en serie (Fig. 1B). Las pruebas t pareadas confirmaron una mejora significativa para las mismas cuatro concentraciones.

Las partículas magnéticas de hidrogel (Nanotrap Particle Workflow 1) mejoran la secuenciación de muestras artificiales de SARS-CoV-2. El SARS-CoV-2 inactivado por calor se agregó a VTM a 102, 103, 104, 105 y 106 TCID50/mL, y las muestras se procesaron utilizando Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] o el kit Rneasy solo [− NT]; n = 3 para cada proceso. A continuación, las muestras se secuenciaron en una celda de flujo ONT MinION R.9 (a) o RT-PCR (b). [+ NT] se compararon con [− NT] mediante la prueba t pareada para evaluar la importancia de una mayor detección viral. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Las extracciones de ARN en columna se utilizan normalmente en entornos de sobremesa de laboratorio de alta complejidad y bajo rendimiento de muestras. Dadas estas limitaciones, evaluamos la capacidad de las partículas magnéticas de hidrogel (partículas Nanotrap) para mejorar un método de extracción de ARN basado en perlas magnéticas. El flujo de trabajo 2 de partículas Nanotrap se probó de manera similar al flujo de trabajo 1: las muestras artificiales de VTM con SARS-CoV-2 se procesaron con ([+ NT]) o sin ([− NT]) partículas Nanotrap. La muestra de [−NT] se procesó usando el kit de aislamiento de ácido ultranucleico MagMAX Microbiome solo. Después de la extracción de ARN, las muestras se prepararon para la secuenciación utilizando el protocolo de secuenciación ARTIC nCoV-2019, ejecutado en la plataforma de secuenciación ONT Mk1C. Las muestras de ARN procesadas también se analizaron mediante RT-PCR utilizando el kit IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR para confirmar la presencia del virus.

Las partículas de nanotrampa mejoraron los resultados de la secuenciación en múltiples concentraciones en comparación con el flujo de trabajo [−NT] (Fig. 2A). Se observó una mejora de 1,9 veces en las lecturas mapeadas virales de SARS-CoV-2 a 106 TCID50/mL y una mejora de 1,4 veces a 105 TCID50/mL. El análisis estadístico confirmó la significación con valores de p < 0,05 calculados para ambos resultados. Además, las partículas de Nanotrap mejoraron la detección de SARS-CoV-2 en RT-PCR, proporcionando una mejora promedio de 1,5 Ct en títulos virales superiores a 102 TCID50/mL (Fig. 2B).

Las partículas magnéticas de hidrogel (Nanotrap Particle Workflow 2) mejoran la secuenciación de muestras artificiales de SARS-CoV-2. El SARS-CoV-2 inactivado por calor se agregó a VTM a 102, 103, 104, 105 y 106 TCID50/mL y las muestras se procesaron con Nanotrap Particle Workflow 2 [+ NT] o el kit MagMAX solo [− NT]; n = 3 para cada proceso. A continuación, las muestras se secuenciaron en una celda de flujo ONT MinION R.9 (a) o RT-PCR (b). [+ NT] se compararon con [− NT] mediante la prueba t pareada para evaluar la importancia de una mayor detección viral. *p < 0,05, **p < 0,01.

Las muestras artificiales de VTM son útiles para evaluar métodos en un entorno prístino, pero no son necesariamente indicativas de cómo funcionará un método con muestras clínicas. Por lo tanto, evaluamos los flujos de trabajo de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) utilizando muestras de VTM de hisopo clínico remanente de diagnóstico. Utilizamos diez muestras de VTM remanentes de diagnóstico con umbrales de ciclo de prueba de RT-PCR informados que oscilan entre 24 y 35 (según lo informado por el proveedor de la muestra). Para estas muestras remanentes de diagnóstico se utilizó el mismo flujo de trabajo de procesamiento y secuenciación establecido con muestras artificiales. Para evaluar mejor el impacto del flujo de trabajo de partículas de Nanotrap en los resultados de la secuenciación, cuantificamos tanto las lecturas mapeadas virales totales como el porcentaje de cobertura del genoma asociado a 30 × de profundidad de las muestras procesadas. Los resultados de la Fig. 3A, que se generaron con Nanotrap Particle Workflow 1[+ NT], muestran que las partículas Nanotrap mejoraron los resultados de secuenciación del 100 % de las muestras remanentes de diagnóstico (n = 10). En comparación con el flujo de trabajo sin partículas Nanotrap [− NT], el uso del flujo de trabajo 1 de partículas Nanotrap resultó en una mejora promedio de 7 veces en el total de lecturas mapeadas virales en todas las muestras remanentes de diagnóstico. Estas mejoras en la lectura mapeada viral dieron como resultado un aumento promedio de la cobertura del genoma viral del 52 % con respecto a las muestras procesadas sin partículas Nanotrap (Fig. 3B). Una prueba t pareada en las 10 muestras muestra que los aumentos son estadísticamente significativos tanto para las lecturas mapeadas virales como para el porcentaje de cobertura (Fig. 3D, Fig. 3E). En la figura 3C, la RT-PCR confirmó la presencia de SARS-CoV-2 para las 10 muestras, lo que también dio como resultado una mejora promedio de 4 Ct con respecto a las muestras [−NT]. Vale la pena señalar que 3 muestras estuvieron por debajo del límite de detección del ensayo RT-PCR cuando se procesaron sin partículas Nanotrap, pero las 10 muestras tenían ARN detectable cuando se usaron partículas Nanotrap en el procesamiento de muestras.

Las partículas magnéticas de hidrogel (Nanotrap Particle Workflow 1) mejoran la secuenciación de las muestras remanentes de diagnóstico de SARS-CoV-2. Se procesaron 10 muestras remanentes de diagnóstico positivas para SARS-CoV-2 utilizando Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] o el kit RNEasy solo [− NT]. Luego, las muestras se secuenciaron en una celda de flujo ONT MinION R.9 y se analizaron mediante Viral Mapped Reads to SARS-CoV-2 (a), Viral Genome Coverage a 30 × profundidad (b) o RT-PCR (c). [+ NT] se compararon con [− NT] mediante la prueba t pareada para evaluar la importancia de una mayor detección viral (d), (e). *** p < 0,001.

Una de las ventajas del procesamiento de muestras basado en partículas magnéticas es que el método se puede automatizar fácilmente. Con ese fin, desarrollamos una versión automatizada del flujo de trabajo de partículas de hidrogel magnético (Nanotrap Particle Workflow 3) para usar en la plataforma de automatización KingFisher. Este método es funcionalmente igual que Nanotrap Particle Workflow 2, utiliza los mismos reactivos y pasos de extracción y se beneficia de las mismas características de rendimiento. Comparamos este método automatizado Nanotrap Particle Workflow 3 ([+ NT]) con un método sin partículas Nanotrap utilizando diez muestras remanentes de diagnóstico positivo para SARS-CoV-2 adicionales ([− NT]), examinando una vez más la secuenciación y la salida de RT-PCR de los dos métodos. Observamos que el procesamiento de partículas Nanotrap mejoró significativamente los resultados de secuenciación para 7 de 10 muestras, lo que resultó en una mejora promedio de 42 veces en las lecturas mapeadas virales totales (Fig. 4A). Esto correspondió a un aumento promedio del 51% en la cobertura del genoma viral en relación con las muestras de [−NT] (Fig. 4B). Las pruebas t pareadas confirmaron que las partículas de Nanotrap mejoraron significativamente tanto las lecturas mapeadas virales (Fig. 4D) como la cobertura del genoma (Fig. 4E). Al igual que con el conjunto anterior de muestras remanentes de diagnóstico, la RT-PCR confirmó la presencia de SARS-CoV-2 en las 10 muestras. El proceso automatizado [+ NT] también mejoró los resultados de la RT-PCR, lo que resultó en una mejora promedio de 3,7 Ct que se muestra en la Fig. 4C.

Las partículas magnéticas de hidrogel (Nanotrap Particle Workflow 3) mejoran la secuenciación de las muestras remanentes de diagnóstico de SARS-CoV-2. Se procesaron 10 muestras remanentes de diagnóstico positivas para SARS-CoV-2 utilizando Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] o el kit MagMAX solo [− NT]. Luego, las muestras se secuenciaron en una celda de flujo ONT MinION R.9 y se analizaron mediante Viral Mapped Reads to SARS-CoV-2 (a), Viral Genome Coverage a 30 × profundidad (b) o RT-PCR (c). [+ NT] se compararon con [− NT] mediante la prueba t pareada para evaluar la importancia de una mayor detección viral (d), (e). *p < 0,05, **p < 0,01.

Después de procesar y secuenciar diez muestras remanentes de diagnóstico positivas para SARS-CoV-2 con Nanotrap Particle Workflow 3, evaluamos más a fondo cómo la mejora en las lecturas mapeadas virales y la cobertura del porcentaje del genoma afectaría el análisis posterior del SARS-CoV-2. Específicamente, utilizamos la herramienta de bioinformática de los laboratorios EPI2ME "Flujo de trabajo ARTIC SARS-CoV-2" para realizar análisis de Pangolin y Nextclade para caracterizar aún más la mejora potencial obtenida por el enriquecimiento de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap). Estas son herramientas de linaje bioinformático de SARS-CoV-2 ampliamente utilizadas para rastrear y analizar variantes de SARS-CoV-2 que producen métricas cualitativas de fácil comprensión para caracterizar y comparar datos de secuenciación. En resumen, Pangolin es una tubería de asignación de linaje de SARS-CoV-2 que comienza alineando una secuencia de entrada con la secuencia original de Wuhan de tipo salvaje. Luego, la herramienta compara cualquier cambio detectado en las regiones de codificación alineadas con una base de datos de variantes conocidas para generar un informe de linaje que genera la variante conocida más cercana. Finalmente, se genera una "puntuación de ambigüedad" que indica la probabilidad de que el informe de linaje sea correcto. Con un rango de 0 a 1, cuanto menor sea la puntuación, menor será la "ambigüedad", lo que equivale a un mayor nivel de confianza de que el análisis es correcto. Similar a Pangolin, Nextclade es una herramienta de alineación de varios niveles que compara una secuencia de entrada con la secuencia de Wuhan identificando las mutaciones que mejor coinciden con las variantes detectadas previamente, lo que da como resultado: un informe de linaje, un recuento de mutaciones, un mapa de alineación que indica la cobertura del genoma y una general Métrica de control de calidad de los datos que se analizan. Utilizamos Pangolin para generar un informe de linaje y una puntuación de ambigüedad para las muestras procesadas [+ NT] y [− NT]. Para las muestras [−NT], Pangolin solo pudo generar un informe de linaje para 3 de 10 muestras con una puntuación de ambigüedad promedio de 0,824. Sin embargo, en presencia de partículas Nanotrap [+ NT], Pangolin pudo caracterizar las 10 muestras, produciendo una puntuación de ambigüedad promedio de 0,898, lo que indica que las partículas Nanotrap pudieron mejorar la capacidad del software para caracterizar muestras (Fig. 5A).

Las partículas magnéticas de hidrogel (partículas de nanotrampa) mejoran las herramientas de bioinformática al analizar muestras de SARS-CoV-2. Se procesaron 10 muestras remanentes de diagnóstico positivas para SARS-CoV-2 utilizando Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] o el kit MagMAX solo [− NT]. Las muestras se secuenciaron en una celda de flujo ONT MinION R.9 y fueron analizadas por Pangolin (a) y Nextclade, que evaluó: la comparación de la puntuación de control de calidad de las 10 muestras (b), las ubicaciones del genoma total que no se pudieron caracterizar por muestra (falta n , menos = mejor) (c), mutaciones totales detectadas por muestra (d).

El análisis de Nextclade reveló una tendencia similar con el uso de partículas Nanotrap, lo que permitió caracterizar más muestras con una calificación de calidad más alta. Nextclade utiliza un sistema de control de calidad de tres niveles: "Bueno", "Mediocre" y "Malo". El nivel de control de calidad indica la cantidad de datos proporcionados que Nextclade pudo caracterizar para evaluar con precisión el genoma viral y determinar una clasificación precisa. Cuando la muestra proporciona datos insuficientes para asignar cualquier clasificación, las muestras reciben "Sin calificación". Aquí, se caracterizaron diez de diez muestras procesadas con partículas Nanotrap, con 6 de 10 muestras recibiendo una calificación de control de calidad de "bueno" y 4 de 10 muestras recibieron una calificación de control de calidad de "malo". Para las muestras de [-NT], 2 de 10 muestras recibieron una calificación de control de calidad de "mediocre" y 6 de 10 muestras recibieron una calificación de control de calidad de "malo". Las 2 muestras restantes no se pudieron caracterizar y no recibieron una calificación, lo que indica que las partículas de Nanotrap mejoraron la capacidad del software para caracterizar las muestras, lo que permitió que las muestras "malas" o "mediocres" anteriores se convirtieran en muestras "buenas" (Fig. 5B). Además, el procesamiento de partículas de Nanotrap mejoró el análisis de Nextclade al disminuir la cantidad de bases faltantes en un promedio de 15 556 "n", o la cantidad de ubicaciones del genoma viral que Nextclade no pudo caracterizar (Fig. 5C). Las "n faltantes" son puntos ciegos del genoma viral que no se pueden usar para determinar si existe una mutación en esa ubicación. Estas "n faltantes" también contribuyen a la calificación de calidad de Nextclade. Cuantas menos "n faltantes", más precisa y útil se vuelve la herramienta Nextclade, lo que permite el análisis de una mayor parte del genoma del SARS-CoV-2. Para las muestras procesadas con partículas Nanotrap, Nextclade detectó un promedio de 9,2 mutaciones más por muestra en comparación con las muestras procesadas sin partículas Nanotrap (Fig. 5D). En general, estos resultados demuestran aún más que el enriquecimiento viral de partículas Nanotrap permite un mejor análisis de muestras utilizando herramientas bioinformáticas comunes.

Idealmente, las tecnologías de concentración viral deberían permitir la concentración de múltiples virus, no solo del SARS-CoV-2. Como han demostrado estudios anteriores, las partículas magnéticas de hidrogel (partículas Nanotrap) capturan una variedad de virus respiratorios; investigamos brevemente si las partículas de Nanotrap también podrían usarse para mejorar la secuenciación de la influenza A (H1N1) y el virus respiratorio sincitial (RSV)18,19,20. El VTM puro se enriqueció por separado a 106 TCID50/mL con influenza A inactivada o RSV. Usando el protocolo de extracción de ARN basado en columnas previamente establecido, las muestras virales artificiales se procesaron con Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] y los resultados se compararon con las muestras procesadas sin partículas Nanotrap [− NT]. Los eluatos de ARN resultantes se prepararon luego para la secuenciación utilizando una versión modificada del protocolo ARTIC Library Prep utilizando cebadores específicos para influenza A y RSV. Las muestras se procesaron en el ONT Mk1C. Los resultados en la Fig. 6A y la Fig. 6C demuestran que las partículas de Nanotrap mejoran los resultados de secuenciación de nanoporos para muestras artificiales de influenza A y RSV, respectivamente. Las partículas de Nanotrap mejoraron las lecturas de mapas virales en 4 veces tanto para la influenza A como para el RSV en comparación con las muestras procesadas sin partículas de Nanotrap. Además, el uso de partículas Nanotrap en el procesamiento de muestras mejoró la detección de ARN viral medido por RT-PCR para influenza A y RSV, respectivamente (Fig. 6B, Fig. 6D). La prueba t pareada confirmó que la mejora impulsada por partículas de Nanotrap fue estadísticamente significativa con valores de p calculados < 0,05. Estos resultados indican que las partículas de Nanotrap se pueden usar para identificar y mejorar los resultados de secuenciación de múltiples virus en muestras de VTM.

Las partículas magnéticas de hidrogel (partículas nanotrap) mejoran la secuenciación de múltiples virus respiratorios. La influenza A (H1N1) (a, b) o RSV (c, d) inactivados por calor se agregó a VTM a 106 TCID50/mL y las muestras se procesaron usando Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] o el kit Qiagen RNEasy solo [− NUEVO TESTAMENTO]; n = 3 para ambos procesos. Luego, las muestras se secuenciaron en una celda de flujo ONT MinION R.9 o RT-PCR. [+ NT] se compararon con [− NT] mediante la prueba t pareada para evaluar la importancia de una mayor detección viral. *p < 0,05, **p < 0,01 , ***p < 0,001.

Los avances recientes en la secuenciación de próxima generación y las técnicas de amplificación posteriores al procesamiento han disminuido los títulos virales necesarios para secuenciaciones exitosas y detección precisa de mutaciones27,28. Si bien estos avances generalmente han mejorado la sensibilidad de las aplicaciones de secuenciación, para ciertas plataformas de secuenciación todavía hay una porción significativa de muestras virales clínicamente relevantes que no se pueden secuenciar debido a títulos virales bajos, muestras en las que hay moléculas de ácido nucleico insuficientes para que las herramientas bioinformáticas cubrir todo el genoma de referencia mientras distingue con confianza la variación biológica del error. Más específicamente, las plataformas de secuenciación "llaman a la base" o crean lecturas de los fragmentos de nucleótidos a partir de las señales sin procesar generadas por el secuenciador a partir de las muestras de ARN procesadas. Estos fragmentos denominados base se comparan y mapean con una base de datos para identificar la taxonomía genómica del fragmento. Durante este proceso de mapeo, las diferencias se propagarán entre la muestra analizada y el genoma de referencia. Estas diferencias en las lecturas pueden deberse a mutaciones genéticas reales oa una llamada de base errónea, la última de las cuales podría ser causada por el propio secuenciador o por material de ácido nucleico insuficiente. Aumentar el número de fragmentos llamados base aclara esta superposición problemática con mayores profundidades de lectura, aumentando la confianza de que las variaciones detectadas son biológicas y no un artefacto11,12,13,14,15.

La plataforma de secuenciación Oxford Nanopore MinION es una tecnología de secuenciación de tercera generación compacta y de baja complejidad que ha reducido significativamente el costo inicial típicamente asociado con la secuenciación. Aunque esta tecnología tiene muchas ventajas atractivas, el conjunto de muestras clínicas utilizables está restringido a muestras de títulos más altos debido a las limitaciones de sensibilidad y precisión29,30,31. Vimos esta limitación como una oportunidad para examinar posibles estrategias de enriquecimiento para mejorar la cantidad de material de ácido nucleico que se secuencia, aumentando el conjunto disponible de muestras clínicas. Con ese fin, aplicamos un método de captura y concentración de virus frontal basado en partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) tanto para VTM artificial como para muestras remanentes de diagnóstico.

Las partículas magnéticas de hidrogel (partículas Nanotrap) mejoraron significativamente los resultados de la secuenciación al capturar y concentrar el SARS-CoV-2 a partir de muestras artificiales, lo que mejoró el resultado de dos métodos estándar de extracción de ARN. Además, identificamos un rango de concentración de trabajo general de SARS-CoV-2 en el que se demostró que las partículas de Nanotrap aumentan significativamente las lecturas mapeadas virales de la plataforma de secuenciación ONT Mk1C. Se observaron mejoras en la secuenciación y la RT-PCR para los flujos de trabajo de partículas 1 y 2 de Nanotrap. En relación con los resultados proporcionados por los kits de extracción de ARN sin preprocesamiento de partículas de Nanotrap, ambos flujos de trabajo mejoraron significativamente las lecturas mapeadas virales totales de SARS-Cov-2 en múltiples concentraciones De los dos flujos de trabajo, se observaron mayores mejoras con el Nanotrap Particle Workflow 1 basado en columnas sobre su comparador. Este flujo de trabajo empleó un volumen de muestra más grande, lo que permitió una cantidad más significativa de enriquecimiento en relación con el comparador.

Para el enfoque del kit de extracción de ARN basado en perlas magnéticas, las lecturas mapeadas virales fueron generalmente más altas en todas las concentraciones para las muestras procesadas con y sin partículas Nanotrap, en relación con las extracciones de ARN basadas en columnas. Esto sugiere una mayor eficiencia de extracción de ARN del kit de extracción de perlas magnéticas, uniendo y eluyendo un mayor porcentaje de ARN. Los resultados de RT-PCR respaldaron esta teoría; observamos que el enfoque de perlas magnéticas permitió la detección de SARS-CoV-2 en una concentración diez veces menor que el enfoque basado en columnas. Las lecturas mapeadas virales fueron más altas para Nanotrap Particle Workflow 2 en comparación con Nanotrap Particle Workflow 1, aunque el rango de concentración para el cual las partículas Nanotrap mejoraron significativamente la cantidad de lecturas fue similar para ambos flujos de trabajo, mejorando los resultados de secuenciación para las muestras de mayor concentración. Si bien estas concentraciones más altas suelen ser menos problemáticas para la secuenciación tradicional sin enriquecimiento previo, la mejora de las muestras de títulos altos aún puede ser útil ya que la profundidad de secuenciación se puede alcanzar más rápidamente, lo que reduce el tiempo requerido para secuenciar y analizar con éxito estos tipos de muestras. Los resultados de la RT-PCR mostraron que el enriquecimiento de partículas de Nanotrap fue eficaz para muestras de menor concentración para ambos flujos de trabajo, lo que sugiere que en una plataforma de secuenciación alternativa con mayor sensibilidad general, las partículas de Nanotrap también podrían mejorar la secuenciación de estas muestras de virus de títulos más bajos.

Además, los resultados indican que los flujos de trabajo de partículas Nanotrap mejoran la secuenciación y los resultados de RT-PCR de muestras remanentes de diagnóstico clínicamente relevantes en comparación con los flujos de trabajo sin partículas Nanotrap. Parece que las partículas de Nanotrap mejoran los resultados de secuenciación de muestras de diagnóstico remanentes de manera más significativa que las muestras VTM artificiales. Las muestras procesadas en este estudio se eligieron para representar una cohorte clínicamente relevante, con valores de Ct que oscilan entre 24 y 35. No parecía haber una estrecha correlación entre los valores de Ct y la utilidad de enriquecimiento de partículas de Nanotrap. Curiosamente, la mayoría de las muestras remanentes de diagnóstico se beneficiaron del enriquecimiento de partículas Nanotrap independientemente de la concentración viral. Esta mejora es aún más convincente cuando se considera el enriquecimiento teórico resultante de la diferencia en el volumen de entrada de la muestra. Para los flujos de trabajo 1 y 3, esperábamos una mejora de 10 × o 2,5 × en relación con las muestras procesadas sin partículas Nanotrap. Sin embargo, esto se superó con creces, ya que observamos un enriquecimiento de más de 40 × en las lecturas mapeadas virales de las muestras remanentes de diagnóstico. Postulamos que el VTM recolectado de humanos generalmente contiene una mayor cantidad de desechos biológicos y, como resultado, es más probable que los flujos de trabajo sin partículas Nanotrap se vean afectados por la inhibición, mientras que el preprocesamiento de partículas Nanotrap reduce este material perjudicial a través de una limpieza adicional de la muestra. Es posible que la arquitectura de partículas de Nanotrap permita la captura del material viral de interés mientras reduce los desechos de la célula huésped y otros materiales contaminantes. El flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de secuenciación evaluado aquí se basó en un paso de amplificación basado en polimerasa que podría verse afectado negativamente por el material celular humano. Limpiar el material de fondo mientras se captura y concentra el material viral permitiría que el flujo de trabajo de Nanotrap mejore aún más este paso de amplificación, generando así mayores lecturas mapeadas virales totales para muestras de VTM remanentes de diagnóstico. Además, este enriquecimiento se observó en muestras con valores de Ct más bajos, muestras que normalmente cumplirían con los criterios de qPCR que dictan una muestra "útil" para la secuenciación, pero que todavía tenían dificultades para generar resultados de secuenciación útiles en la práctica. Esto puede indicar que el flujo de trabajo de hidrogel magnético podría ser útil no solo para muestras de títulos bajos, sino también para muestras clínicas con concentraciones más altas que fallan en la secuenciación.

Las partículas de nanotrampa mejoraron significativamente las lecturas de mapas virales de una gran mayoría de las muestras remanentes de diagnóstico para ambos flujos de trabajo. Como resultado, la cobertura del genoma viral también aumentó para la mayoría de las muestras remanentes de diagnóstico, aumentando en un 80 % en ciertas muestras remanentes de diagnóstico. Estos datos sugieren que las partículas de Nanotrap podrían aumentar significativamente la fracción de muestras que podrían usarse para la secuenciación, aunque se debe analizar un conjunto de muestras más grande para confirmarlo. Vale la pena señalar que algunas de las muestras en las que no hubo una mejora estadísticamente significativa cuando se utilizaron las partículas de Nanotrap, ya tenían una cobertura genómica relativamente completa cuando se procesaron sin partículas de Nanotrap.

Para evaluar más a fondo la utilidad práctica de la mejora observada al usar las partículas Nanotrap, también analizamos los datos de secuenciación con Pangolin y Nextclade, dos herramientas bioinformáticas que se usan comúnmente a nivel mundial para rastrear y analizar variantes del SARS-CoV-232,33,34. Estas herramientas se seleccionaron en función de su capacidad para detectar y clasificar mutaciones, sus requisitos de datos para un análisis de variantes exitoso y sus respectivas métricas cualitativas que dictan la calidad de la información. Esto proporcionó un sistema de clasificación que usamos para determinar mejor qué tan impactante es el enriquecimiento de partículas Nanotrap para los datos de secuenciación. Observamos que para la mayoría de las muestras remanentes de diagnóstico analizadas, el proceso de partículas Nanotrap permitió que estas herramientas bioinformáticas funcionaran de manera más efectiva y, para ciertas muestras de títulos bajos, permitió que tanto Pangolin como Nextclade completaran un análisis exitoso que de otro modo habría fallado debido a a datos insuficientes. Nextclade también pudo mapear mejor todo el genoma del SARS-CoV-2 para las muestras de Nanotrap, identificando más mutaciones totales por muestra en relación con el control [−NT]. Esto sugiere que las partículas Nanotrap potencialmente permiten a los investigadores rastrear y detectar de manera más efectiva variantes que pasarían desapercibidas sin la sensibilidad mejorada proporcionada por el proceso de partículas Nanotrap.

Para que la secuenciación sea más útil en entornos de salud pública, se deben abordar las consideraciones sobre el rendimiento de la muestra y el flujo de trabajo. Los sistemas automatizados, como la plataforma de automatización KingFisher, son fácilmente escalables y ya se utilizan como herramienta de procesamiento en laboratorios clínicos35. Las partículas de Nanotrap mejoraron los resultados de secuenciación de diez muestras remanentes de diagnóstico positivas cuando se procesaron con Nanotrap Workflow 3, lo que demuestra su utilidad en un sistema automatizado de alto rendimiento. Vale la pena señalar que este método automatizado permitiría el procesamiento de 96 muestras en 1 h, lo que es significativamente más rápido y mucho más fácil de usar que el método de extracción manual en columna, lo que lo convierte en una propuesta atractiva para laboratorios de rendimiento medio a alto.

Además del SARS-CoV-2, las partículas de Nanotrap han demostrado su utilidad para capturar una amplia gama de virus, incluidos los patógenos respiratorios17,18,19,20,21. Sin embargo, hasta la fecha, nunca se han publicado datos de secuenciación viral cuando se utiliza un flujo de trabajo de partículas Nanotrap. Aquí, confirmamos informes anteriores que muestran que las partículas de Nanotrap también pueden capturar y concentrar la influenza A y el RSV, dos virus respiratorios comunes. Además, demostramos que nuestro flujo de trabajo de partículas Nanotrap es compatible con la secuenciación de múltiples patógenos respiratorios, lo que aumenta las lecturas mapeadas virales de ambos virus. Esto sugiere que los flujos de trabajo de partículas Nanotrap se pueden utilizar para mejorar la detección viral a gran escala mediante secuenciación.

Este estudio contiene ciertas limitaciones, comenzando por el número de muestras evaluadas. Se probó una cantidad suficiente de réplicas para determinar una mejora positiva proporcionada por el proceso de partículas Nanotrap al secuenciar muestras de VTM, pero se deben analizar más muestras para cuantificar mejor y con mayor precisión el enriquecimiento de veces que puede proporcionar el flujo de trabajo. Tampoco evaluamos directamente la capacidad de las partículas Nanotrap para mejorar la secuenciación de diferentes variantes del SARS-CoV-2. Sin embargo, dada la naturaleza general de captura viral de las partículas Nanotrap, esperamos que las mejoras en la secuenciación observadas con el SARS-CoV-2 de tipo salvaje correspondan a las mejoras en la mayoría de las otras variantes del SARS-CoV-2. Los experimentos futuros podrían probar esta hipótesis mediante la evaluación del enriquecimiento de partículas Nanotrap de muestras con variantes conocidas sobre la base de una mayor detección. También podríamos crear un grupo de prueba de muestras remanentes de diagnóstico con variantes conocidas en títulos más bajos para examinar si el flujo de trabajo de partículas Nanotrap puede aumentar la cantidad de muestras clínicas disponibles para la secuenciación al mismo tiempo. Además, dado que solo se examinaron muestras artificiales de influenza A y RSV, no podemos afirmar definitivamente en este momento que el proceso de partículas Nanotrap sea capaz de secuenciar estos patógenos respiratorios en medios biológicamente más complejos. Tampoco examinamos lo que ocurre en las muestras que están coinfectadas con múltiples virus. Esto podría sesgar potencialmente las partículas de Nanotrap hacia un virus específico en caso de que ese virus tenga una mayor afinidad por las partículas de Nanotrap que otros. Los experimentos futuros deberían examinar cómo se comportan las partículas de Nanotrap en una muestra coinfectada, junto con el uso de muestras remanentes de diagnóstico más relevantes clínicamente que contengan influenza A o RSV. También hay espacio para explorar aplicaciones adicionales de este enfoque para tipos de muestras alternativas, incluido el fluido oral (que podría usarse para pruebas respiratorias virales menos invasivas) y aguas residuales (que podrían usarse para realizar la vigilancia de patógenos respiratorios virales en las comunidades). En el futuro, planeamos abordar cada una de estas áreas para que podamos continuar examinando las aplicaciones de vigilancia viral con esta tecnología de enriquecimiento versátil.

En general, este estudio indica que el enriquecimiento de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) permite la secuenciación de muestras clínicas desafiantes en VTM utilizando el ONT MinION Sequencer, muestras que de otro modo podrían no haber sido adecuadas para la secuenciación. Debido a que nuestro método no requiere pasos de filtración o centrifugación, este enfoque es compatible con entornos de rendimiento medio y alto, incluida la plataforma de automatización KingFisher. Además, un método de concentración de partículas de hidrogel magnético (partículas Nanotrap) combinado con una plataforma de secuenciación ONT permite esfuerzos de secuenciación más accesibles. Dado el costo relativamente bajo y la portabilidad de ambas tecnologías, este sistema combinado podría implementarse potencialmente en áreas con recursos de laboratorio limitados y acceso limitado a equipos de secuenciación más tradicionales.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de Github, https://github.com/Ceres90/NT-Extraction-Data. Genoma de referencia: síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 aislado Wuhan-Hu-1, número de acceso del genoma completo: NC_045512.

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Esta publicación fue apoyada por la subvención SBIR 1 R43IP001142-01 de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades y por la iniciativa NIH Rapid Acceleration of Diagnostics (RADxSM) financiada en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería , Institutos Nacionales de Salud, Departamento de Salud y Servicios Humanos, bajo el Contrato No. 75N92020C00021. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades o los de los Institutos Nacionales de Salud.

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Dirección actual: Ceres Nanosciences, Inc., Manassas, VA, 20110, EE. UU.

Ceres Nanosciences, Inc., Manassas, VA, 20110, EE. UU.

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PA, NS, DG, JF y KB llevaron a cabo los experimentos, contribuyendo a la captura viral, extracción viral y detección viral. AP, DM, SM, SS, RK,CR,SM,DW,JS,FN, OS, AM,KK y KH contribuyeron a la producción y el control de calidad de las partículas Nanotrap®. PA, RB, TJ, BL, SB, RD y RAB contribuyeron a la presentación y el formato de los datos. PA, SB, RAB y BL analizaron e interpretaron los datos y participaron en el diseño experimental. PA, RB, TJ, BL, SB, RD y RAB participaron en la redacción y edición del manuscrito y también proporcionaron la dirección y coordinación general de este estudio. Todos los autores aprobaron el manuscrito.

Correspondencia con P. Andersen o B. Lepene.

Pensilvania, SB, RAB, NS, JF, KB, DG, RB, RD, TJR, RK, SM, CR, AM, SM, LS, DM, SS, OS, KH, DW, KK, FN, JS, AP, BL son empleados de Ceres Nanosciences Inc.

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Reimpresiones y permisos

Andersen, P., Barksdale, S., Barclay, R. et al. Las partículas magnéticas de hidrogel mejoran la secuenciación de nanoporos del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios. Informe científico 13, 2163 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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Recibido: 18 Abril 2022

Aceptado: 31 de enero de 2023

Publicado: 07 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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